辅助菌共培养条件对橙色粘球菌次生代谢产物的影响

黄艳 胡建伟 朱红惠

（1.塔里木大学 塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，阿拉尔 843300；2.广东省微生物研究所 广东省华南应用微生物重点实验室培育基地 广东省微生物菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物新技术公共实验室，广州 510070）

粘细菌属于δ-变形杆菌纲（Deltaproteobacteria），粘细菌目（Myxococcales），包括3个亚目，7个科，21个属［1-3］，具有复杂的生活发育史，被认为是高等原核生物［4，5］，仅次于放线菌之后又一具有开发价值的药源微生物［6-9］。然而粘细菌分离纯化困难，生长缓慢，次生代谢产物得率低［10］，严重制约了粘细菌研究工作的深入开展。有研究表明，与其它类群细菌共培养，对粘细菌的生长更有利［11］，这些细菌菌株被称为辅助菌（helper bacteria）。Jacobi等［12］证实大部分软骨霉状菌属（Chondromyces）粘细菌的生长都依赖于鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）的一种圆形细菌，只有后者存在时，前者才能正常生长繁殖。然而辅助菌共培养对粘细菌的次级代谢产物有何影响，目前仍不清楚。

本课题组在新疆盐碱地环境中分离得到一株橙色粘球菌（Myxococcus fulvus），编号为8.5［13］，同时筛选到2株辅助菌，分别为42号和43号细菌，它们能被橙色粘球菌8.5捕食。本研究通过在液态培养方式下加入辅助菌与粘细菌共培养，研究辅助菌对橙色粘球菌次生代谢产物的影响，以期提高橙色粘球菌的次生代谢产物的产率。

1 材料与方法

1.1 材料

橙色粘球菌（M. fulvus）8.5菌株，微枝形杆菌属（Microvirga sp.）细菌编号为42号，无色杆菌属（Achromobacter sp.）细菌编号为43号辅助细菌均由本课题组分离鉴定得到，保存于广东省微生物菌种保藏中心。

薄层层析采用烟台市化学工业研究所的TLC高效薄层层析板（GF254）；离心机为Beckman的AvantiJ-20xp型离心机；分析色谱柱为Agilent C18柱（250 cm×4.6 mm）；高效液相色谱仪为Agilent 1260；色谱纯甲醇和乙腈为Fisher Scientific公司生产，其他有机试剂均为分析纯，购于广州化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 橙色粘球菌最佳生长培养基的选择 选择CY、Ht、Ht1和VY-2 四种培养基。将橙色粘球菌8.5分别接种于上述4种液体及固体培养基中，液体培养于30℃，150 r/min的恒温摇床中进行，固体培养于30℃的恒温培养箱中进行。细菌接种后，每天观察、记录菌体的生长情况，选择最适宜其生长的培养基。

CY、Ht、Ht1和VY-2四种培养基的pH约为7.2，主要配方（以下为1 L培养基的配方，固态培养基加入1.5%-2%的琼脂）如下。

CY培养基：酪蛋白胨0.3 g；酵母浸出粉0.1 g；CaCl2·2H2O 0.1 g。

Ht培养基：磷酸二氢钾0.1 g；氯化钙0.01 g；硫酸镁0.03 g；硫酸亚铁0.001 g；硝酸钠0.25 g；可溶性淀粉2%。

Ht1培养基：磷酸二氢钾0.1 g；氯化钙0.01 g；硫酸镁0.03 g；硫酸亚铁0.001 g；硝酸钠0.25 g。

VY-2培养基：安琪活性干酵母0.5 g；维生素B120.05 mg；氯化钙0.1 g。

1.2.2 液态发酵时辅助菌最佳加入时间段的试验 选择VY-2培养基进行橙色粘球菌8.5与42号、43号辅助菌的共培养试验。将VY-2液体培养基分装为25 mL/瓶的100 mL三角瓶中，共50瓶。将橙色粘球菌8.5适量接种于各瓶液体培养基中，于30℃，150 r/min震荡培养7 d。将42号、43号辅助菌培养至12 h时，每隔12 h分别接种于上述生长状态良好的橙色粘球菌8.5的VY-2培养基中，接入时间分别为橙色粘球菌生长至：0、12、24、48、60、72、84和96 h（0 h即为粘细菌与辅助菌同时接入，12 h即为粘细菌生长12 h后接入辅助菌，依次类推），接种量为0.1 mL，每个时间点做3个平行，每天观察菌体生长情况，空白对照（CK）为未接入辅助菌的橙色粘球菌8.5单独培养。同样，也将42号、43号细菌进行相同方法的单独培养。

培养7 d，收集发酵液，用低温冷冻离心机4℃，6 000 r/min离心15 min后将菌体和上清分开收集；收集菌体，离心后将离心管倒置数分钟后，至无水分流出，用分析天平称量，得到湿菌体得率；上清用等体积的乙酸乙酯充分萃取3次，乙酸乙酯相用旋转蒸发仪蒸发、浓缩、干燥后，得到粗提物，空白对照及42号、43号菌的处理与之相同，得到粗提物的得率。

1.2.3 单独培养及共培养时粗提物的HPLC分析 将最佳时间段加入辅助菌共培养后的发酵产物（乙酸乙酯相），8.5与42号、43号细菌单独培养的发酵产物（乙酸乙酯相）取等量粗提物经甲醇溶解后，用微孔滤膜过滤，进行HPLC分析，方法为：流动相溶剂为：A为0.2%的乙酸、水，B为甲醇，流速为1 μL/min，检测波长为214 nm。得到共培养与单独培养时代谢产物的变化情况分析图谱。

2 结果

2.1 橙色粘球菌8.5最佳生长的培养基

固体平板培养时，橙色粘球菌8.5可在Ht上生长，Ht1上未能生长，在CY和VY-2培养基中的生长状态较好。在相同生长时间中，橙色粘球菌8.5在CY培养基中的扩展菌落圈更均匀，但菌层薄；8.5在VY-2培养基中的扩展菌落圈小，但中间菌落扩展层厚，边缘较薄（图1）。

图1 橙色粘球菌8.5在CY培养基（a）和VY-2培养基（b）的生长第3天比较

如表1所示，在液体培养时，橙色粘球菌8.5在Ht和Ht1培养基中的生长状态不佳，说明仅有淀粉和无机盐的寡营养培养基不足以满足该橙色粘球菌8.5的生长。8.5在CY和VY-2培养基中生长情况良好。液态发酵时，测得乙酸乙酯相的粗提物得率分别为0.32 g/L和0.28 g/L。但考虑到工业化生产时VY-2较CY成本更低，因而，液态发酵时加入辅助菌最佳时间段的试验选用VY-2培养基。

2.2 液态发酵时加入辅助菌的最佳时间段

表1 橙色粘球菌8.5在不同生长培养基中的生长状况比较

图2 42号辅助菌共培养时加入时间点对橙色粘球菌生长和次级代谢产物的影响

图2-A显示，空白对照（CK）：只在VY-2培养基加入粘细菌8.5发酵7 d得到的粗提物浸膏得率为0.24 g/L。0-96 h不同时间点加入42号辅助菌共培养使得粗提物得率均有所增加。增幅为：0.05-0.40 g/L。其中，72 h和84 h时加入42号辅助菌，发酵粗提物浸膏的得率最大，为0.64 g/L；图2-B显示，空白对照（CK）：只在VY-2培养基接入橙色粘球菌8.5发酵相同时间得到的湿菌体得率为14.88 g/L。42号辅助细菌与橙色粘球菌8.5共培养时，除12 h加入辅助菌共培养的湿菌体得率低于橙色粘球菌8.5单独培养时的湿菌体得率外，其他时间加入辅助菌共培养使得湿菌体得率均有提高，增幅为：0.28-9.68 g/L。72 h加入42号辅助菌共培养使得湿菌体得率最高，为24.55 g/L。

图3 43号辅助菌共培养加入时间点对橙色粘球菌生长和次级代谢产物的影响

图3-A显示，空白对照（CK）：只在VY-2培养基加入橙色粘球菌8.5发酵7 d得到的粗提物浸膏得率为0.24 g/L。0-96 h不同时间点加入43号辅助菌共培养使得粗提物得率均有所增加。增幅为：0-0.45 g/L。其中，橙色粘球菌8.5与43号辅助菌同时接入共培养时，发酵粗提物浸膏的得率最大为0.69 g/L；图3-B显示，空白对照（CK）：只在VY-2培养基接入橙色粘球菌8.5发酵相同时间得到的湿菌体得率为14.875 g/L。43号辅助细菌与橙色粘球菌8.5共培养时，湿菌体得率均有提高，增幅为：2.28-10.73 g/L。96 h加入43号辅助菌共培养使得湿菌体得率最高，为25.60 g/L。

对加入辅助菌共培养时，辅助菌自身能够被橙色粘球菌8.5所捕食。对湿菌体得率及乙酸乙酯萃取后粗提物的得率进行分析，结果表明，加入42号及43号辅助菌与橙色粘球菌8.5共培养时湿菌体得率及粗提物得率大体上均有所增加。其中，42号辅助菌72 h和84 h时加入共培养，发酵粗提物浸膏的得率最大为0.64 g/L；72 h加入共培养，湿菌体得率最高，为24.55 g/L；43号辅助细菌与橙色粘球菌8.5同时接入共培养时，粗提物得率最高为0.69 g/L，96 h加入共培养，湿菌体得率最高，为25.60 g/L。

2.3 不同辅助菌与橙色粘球菌8.5共培养的粗提物成分特征

图4-A显示，42号辅助菌与橙色粘球菌8.5共培养时的出峰情况相较于橙色粘球菌8.5单独培养时，基本一致；图4-B显示，43号菌与橙色粘球菌8.5共培养时，相较于橙色粘球菌8.5单独培养产生的部分峰减少，如17.341 min，28.882 min，29.995 min，部分峰增多，如4.389 min。

综合图4-A、B可见，43号辅助菌相较于42号辅助细菌出峰更少，表明两株细菌的代谢产物生成情况可能并不丰富。在保证粘细菌原有次生代谢产物基本一致时，应该选择42号辅助菌与橙色粘球菌8.5共培养为最佳辅助细菌。如若考虑得到4.389 min的代谢产物，则可选择43号菌与橙色粘球菌8.5共培养。

3 讨论

野生粘细菌的次级代谢物产量很低，给活性产物的分离纯化、结构鉴定等带来很大困难［10］。很多研究者通过不同方法提高次级代谢产物得率：例如王宁等［14］通过培养基和培养条件优化，刘迎等［15］通过加入次级代谢产物的粗提物作为诱导物均达到了提高次生代谢产物得率的效果。Margarita等［16］的研究发现辅助菌的加入能够缩短布拉克须霉（Phycomyces blakesleeanus）的休眠时间，因此，本研究采用辅助菌与橙色粘球菌8.5共同培养的方法，尝试解决粘细菌次级代谢产物得率低的问题。研究发现，在粘细菌分泌次生代谢产物时，发现辅助菌的加入，能够促进橙色粘球菌的生长，并可被橙色粘球菌所捕食，而不同时间加入辅助菌的作用效果不同，在最佳时间加入辅助菌会对代谢产物的得率产生更好的影响。对湿菌体得率而言，橙色粘球菌8.5培养至72 h加入42号辅助菌共培养最佳，培养至96 h加入43号辅助菌共培养最佳；对粗提物得率而言，橙色粘球菌8.5培养至72 h和84 h时加入42号辅助菌共培养最佳，橙色粘球菌8.5与43号辅助菌同时接入共培养最佳。黄兵［17］的研究证实共培养体系的成功建立关键在于两株菌的接种时间及接种顺序等，本试验结果也验证了这一结论。

图4 不同辅助菌与橙色粘球菌共培养时HPLC分析图谱

两株辅助菌与橙色粘球菌8.5共培养后的次生代谢产物成分有所不同，42号辅助菌的加入基本不改变橙色粘球菌原有的次生代谢组分，43号辅助菌的加入能够改变橙色粘球菌的部分次生代谢组分。郭鹏飞等［18］的研究表明海绵来源的微生物共培养可以产生新的活性代谢产物。这表明两株辅助菌与橙色粘球菌共培养的作用机制不同。对粘细菌在加入辅助菌共培养后产生的次生代谢产物组分不同的原因作以下几点推测：（1）捕食行为引起次生代谢产物的变化，辅助菌被粘细菌捕食后，开启了不同于单独培养时新的代谢方式；（2）两株菌株协同作用的结果，自然环境中微生物的互作现象普遍［19］，有研究表明，巨大芽孢杆菌胞外液能促进产酸菌产酸［20］。本试验可能由于共培养的微生物在生长过程中各自产生的酶类相互协同作用将同一底物转化为另一物质；（3）沉默基因的激活，Hopwood［22］在1980年初提出通过菌株或种间自然接合等方法可以激活某些沉默的抗生素相关基因，从而获取新抗生素和新活性物质。

4 结论

本研究采用辅助菌与橙色粘球菌共培养方式研究对次级代谢产物的影响，加入的辅助菌能够被粘细菌捕食。发现共培养后能够总体上增加橙色粘球菌的生物量及次生代谢产物得率；42号辅助菌的加入基本不改变橙色粘球菌原有的次生代谢组分，43号辅助菌的加入能够改变橙色粘球菌的部分次生代谢组分。但试验仍存在缺陷，未能找到使橙色粘球菌代谢产物形成更为丰富的辅助菌。筛选已有粘细菌的辅助菌株，进行与粘细菌共培养研究，将有利于促进粘细菌资源的开发与利用。

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