乌鸡白凤丸抗肝纤维化作用的实验研究＊

王 萍 郭雪艳 王芳婷 牛建平 朱云清 陕西省人民医院消化内科（西安710068）

肝纤维化甚至肝硬化是慢性肝病发展演变的过程，临床表现为乏力、食欲不振、恶心、呕吐、黄疸、腹水等，仅能采取对症处理，目前国内外尚缺乏理想的抗肝纤维化及其进展的药物。临床上我们发现，在某些肝纤维化或肝硬化患者的治疗中乌鸡白凤丸可部分改善患者的腹胀、乏力等症状，使肝功好转，为临床治疗肝纤维化甚至肝硬化提供了一种新治疗方法。为了进一步研究、探讨乌鸡白凤丸在抗肝纤维化中的作用及其机制，我们设计并进行了本实验。

1 实验材料 1.1 试验药物 乌鸡白凤丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，国药准字：Z11020091 批号：20120501）加蒸馏水碾匀溶解，配成浓度为720g／L 的药液备用。四氯化碳分析纯（Carbon tetrachloride，CCl4）、橄榄油及秋水仙碱均购自西安沃尔森生物技术有限公司。秋水仙碱用生理盐水配制浓度为1mg／mL。采用橄榄油将四氯化碳配制成浓度为30%的四氯化碳橄榄油，做为Wistar大鼠肝硬化的造模剂。

1.2 实验大鼠 Wistar大鼠雌雄各半共90只，体重170～200g，年龄6～8周，全部购自西安交通大学医学院动物实验中心。

1.3 实验大鼠分组 共有90只Wistar大鼠，随机平均分为A 组（正常对照组）：不要任何药物；B组（模型对照组）：仅用30%CCL4橄榄油注射于大鼠腹腔内（每100g 0.2mL）制备肝纤维化模型；C 组（蒸馏水治疗组）：在上述制备肝纤维化模型过程中，同时给予蒸馏水10mL／（kg.d），灌胃；D 组（秋水仙碱治疗组）在上述制备肝纤维化模型过程中，同时给予秋水仙碱液按1mg／（kg.d）灌胃；E组（乌鸡白凤丸治疗组）：在上述制备肝纤维化模型过程中，同时给予乌鸡白凤丸10 mL／（kg.d）灌胃，1d1次。实验过程共8周。平均每组18只，雌雄各半。

1.4 鼠抗人α－SMA 单克隆抗体（1∶200）购自Santa Cruz公司（美国），山羊抗鼠II抗、即用型SABC 试剂盒、DAB 显色试剂盒等均购自西安沃尔森生物技术公司。

2 实验方法 2.1 肝纤维化大鼠模型的制备 按照文献［1］报道用30% CCL4橄榄油注射于大鼠腹腔内（每只100g 0.2mL），每周2次，共8周。

2.2 标本的采集 8周后，对各组大鼠用1%戊巴比妥钠（40mg／kg）行腹腔注射麻醉。无菌条件下对大鼠的心脏采血，分离其血清，置－20℃保存。同时摘取大鼠肝脏左叶用石蜡包埋，制作成石蜡切片，行组织病理学检查。

2.3 血清学检查及病理学检查 自动生化分析仪检测血中ALT、AST，用放免方法检查透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层粘连蛋白（laminin，LN）、III型胶原（PC－III）的浓度，ELISA 方法检测血清中TGF－β、TNF－α的水平。

病理学采用肝脏组织常规石蜡切片HE 染色。在光镜下观察按照肝纤维化半定量计分系统（SSS）方法［2］，由2名有经验的病理科医师对所有切片进行盲法观察，并按SSS方法对所有对各组大鼠肝纤维化程度评分。最高29分，最低0分；得分越高，表示纤维化程度越重。

2.4 免疫组织化学 采用SABC 法，常规脱蜡水化；PBS漂洗；抗原修复；加入α－SMA 抗体（1：200），4℃过夜封闭；滴加二抗抗体；DAB显色，封片。用正常血清作阴性对照。每张切片随机选择5个视野，采用专业多媒体图文分析系统技术每个视野中阳性部分及棕黄色的总像素占视野总像素值的比例，作为活化肝星状细胞（HSC，hepatic stellate cell）在肝组织中所占的比例。

2.5 统计学方法 应用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析。多组数据间比较采用单因素方差分析（One－Way ANOVA），以P ＜0.05为差异有显著性。

3 实验结果 3.1 血清学结果 见表1。乌鸡白凤丸治疗组（E 组）及秋水仙碱治疗组（D 组）血清ALT、AST、HA、LN、PCIII、TNF－α、TGF－β含量较蒸馏水处理组（C 组）、模型对照组（B组）降低，而较正常对照组（A）高，通过单因素方差分析，各组间的差异均有统计学意义（P ＜0.05）。但乌鸡白凤丸处理组（E组）与秋水仙碱处理组（D 组）比较以上各组血清学数值无明显统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组指标结果比较（±s）

表1 各组指标结果比较（±s）

①乌鸡白凤丸处理组（E组）、秋水仙碱处理组（D 组）及正常对照组（A 组）分别与模型组（B组）及蒸馏水处理组（C 组）比较：ΔP ＜0.05。②乌鸡白凤丸处理组（E组）与秋水仙碱处理组（D 组）比较：▲P＞0.05。

指 标A 组B组C组D 组E组ALT（U／L）40.45±8.10Δ270.40±70.12 267.31±72.51 85.46±29.47Δ81.32±30.12Δ▲AST（U／L）320.15±56.17Δ560.12±50.17 555.35±53.45 320.25±65.18Δ340.17±55.36Δ▲HA（ng／mL）120.13±30.15Δ340.42±72.80 335.12±40.70 190.72±38.72Δ180.52±40.12Δ▲LN（ng／mL）170.15±20.13Δ360.72±30.18 360.12±29.75 260.13±30.40Δ240.12±20.12Δ▲PC－III（pg／mL）0.190±0.007Δ0.415±0.008 0.410±0.009 0.198±0.005Δ0.172±0.007Δ▲TNF－α（pg／mL）0.2510±0.072Δ0.568±0.008 0.565±0.004 0.245±0.004Δ0.256±0.003Δ▲TGF－β（pg／mL）0.182±0.005Δ0.651±0.007 0.650±0.005 0.175±0.006Δ0.187±0.003Δ▲SSS评分0.042±0.045Δ25.350±4.125 25.423±4.215 5.135±1.354Δ5.005±1.025Δ▲图像分析（%）0.512±0.456Δ7.348±1.245 7.285±1.365 0.802±0.415Δ0.792±0.528Δ▲

3.2 HE染色 正常组大鼠肝脏组织结构清晰，肝细胞大小均匀，无变性、坏死，肝小叶结构存在，小叶内肝细胞索排列较整齐，偶见双核肝细胞；模型组肝细胞及蒸馏水处理组肝细胞可见明显脂肪变性、气球样变性，多分布于界板周围，可见较多双核肝细胞，汇管区纤维组织明显增生，部分肝小叶结构存在；乌鸡白凤丸处治疗组脂肪变性和气球样变性明显减轻，纤维组织增生不明显。

3.3 α－SMA 免疫组化染色 显微镜下重点观察黄色胶原纤维分布情况。正常组（A 组）仅于血管周围可见少量黄色纤维，细且短；肝纤维化模型组（B组）肝脏组织中纤维明显增多，分布广泛，可相互连接形成较粗大的纤维间隔，多位于汇管区和血管周围；乌鸡白凤丸处理组（E 组）仅见少量较细的黄色纤维表达于炎细胞浸润、聚集区，纤维间隔区，及靠近纤维间隔的血窦区，汇管区的血管壁，见图。

图像分析显示：B组α－SMA 抗体阳性率最高；A 组最少；乌鸡白凤丸治疗组的阳性率较B和C组明显减低，接近秋水仙碱治疗组，见表1。

3.4 SSS计分结果 与正常对照组相比，模型对照组大鼠纤维化明显（P ＜0.01）。与模型对照组相比，乌鸡白凤丸治疗组（E组）及秋水仙碱性治疗组（D 组）肝纤维化SSS计分明显下降，示乌鸡白凤丸治疗组肝纤维化程度明显减低（ΔP ＜0.05）。而E组与D 组比较，肝纤维化计分无明显差异（▲P＞0.05），见表1。

组织切片α－SMA 免疫组化染色正常组

α－SMA 免疫组化染色肝纤维化模型组

α－SMA 免疫组化染色乌鸡白凤丸治疗组

4 讨 论 肝纤维化是慢性肝病进展演化的主要途径，同时也是肝炎逐步转化为肝硬化或肝癌的必经途径。目前肝硬化及肝纤维化机制比较复杂，得到公认的如下各种因素共同作用导致肝细胞损伤，激活库普弗细胞，并随同内皮细胞及肝细胞等分泌各种细胞因子如TGF－β、TNF－α、PDGF、胰岛素样生长因子（IGF）、纤维生长因子（FGF）等及某些化学介质，共同作用于静息状态肝脏星型细胞（HSC）并使其激活，并通过自分泌和旁分泌作用使HSC 增殖，合成分泌大量细胞外基质（ECM ），并且抑制ECM 降解，造成ECM 过量沉积，导致肝脏结构改变，肝纤维化及肝硬化发生。静止的HSC 不表达α－SMA，活化的HSC具有平滑肌细胞的特性，表达α－平滑肌肌动蛋白（α－SMA），具有收缩功能，因而α－SMA 可作为HSC 活化的标志［3］，并对肝脏的纤维化程度进行评估。

通过各种研究及文献报道，目前临床上以LN、HA、PCIII定位反应作为肝纤维化及肝损害的定量标志物［4］。通过本实验，我们采用放免法对血清中TGF－β、TNF－α及HA、LN、PCIII的水平进行检测，发现在肝纤维化形成过程中，以上因子的水平均显著升高，但通过乌鸡白凤丸处理组的各项指标均较模型组明显减低，且目前多重实验已证明秋水仙碱在肝纤维化形成中有保护作用，本组实验乌鸡白凤丸组与秋水仙碱处理组比较无明显差异。说明乌鸡白凤丸在肝纤维化演变中，对TGF－β、TNF－α及HA、LN、PCIII均有显著地下调，同时从病理学方向，观察到乌鸡白凤丸治疗后α－SMA 表达水平明显下降，进一步说明乌鸡白凤丸可部分抑制肝星状细胞的活性，减少肝纤维化过程中假小叶的形成，改善肝脏结构。分别从血清学及组织病理学水平证明了乌鸡白凤丸在大鼠肝纤维化形成中具有一定的保护作用，一定程度上延缓了肝纤维化进程。

而同仁堂乌鸡白凤丸的原始配方源自明代龚廷贤撰《寿世保元》中的白凤丹、乌鸡丸。传统功效为补气养血、调经止带，用于气血两虚、身体瘦弱、腰膝酸软。是一种经典的治疗妇科疾病的传统中药。近年来有文献报道［6］发现在临床实践中乌鸡白凤丸早期肝硬化有作用，且安全性能良好。通过本实验，我们观察到乌鸡白凤丸在大鼠肝纤维化形成中有一定的保护作用。

另有研究［7］表明乌鸡白凤丸具有增强脏解毒功能，促进肝糖元和蛋白质的新代谢，从而对肝损伤起保护作用，且有调整体内免疫和细胞免疫功效，这对减轻肝细胞损害，促进肝功能好转均有积极作用，对肝硬化、纤维化有抑制作用。

如何利用祖国的传统医药乌鸡白凤丸，进行老药新用，使其在肝病治疗领域发挥更大的作用是我们今后临床工作的方向之一。

［1］ 苗明山.实验动物和动物实验技术［M］.北京：中国中医药出版社，1997：226.

［2］ 曾民德，王泰龄，王宝恩.肝纤维化诊断及疗效评估共识［J］.肝脏，2002，7（2）：3.

［3］ Milani S，Herbst H，Schuppan D et al.Cellular location of laminin gene transcripts in normal and fibrotic human liver［J］.Am J Pathol，1989，134：1175－1182.

［4］ Esmat G，Metwally M，Zalata KR，et al.Evaluationg of serum biomarkers of fibrosis and injury in Egyptian patients with chronic hepatitis C［J］.Hepatal，2007，46（4）：620－627.

［5］ Yin MF，Lian LH，Piao DM，et al.Tetrandrine stimulates the apoptosis of hepatic stellate cells and ameliorates development of fibrosis in a thioacetamide rat model.World［J］.Gastroentrol，2007，13（8）：1214－1220

［6］ 刘洪明，毕青，张俊富.乌鸡白凤丸对肝硬化白蛋白的影响［J］.天津中医药2003，20（1）：29.

［7］ 李晓芹，贺 蓉，周爱香，等.乌鸡白凤丸口服液及丸剂对中毒性肝损伤影响的比较［J］.中药药理与临床，2000，16（4）：1－2.