痹宁胶囊对痛风性关节炎患者HPRT基因水平的影响研究

佟颖，苏冠霞，金汤，王博，杨福庆，孟洁，杨新

(1．黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;3．哈尔滨市中医医院，黑龙江 哈尔滨 150008;4．黑龙江省饶河县中医院，黑龙江 饶河 155700)

痛风和高尿酸血症是多基因遗传性疾病，血尿酸升高是痛风发病的重要生化基础，经我课题组研究进一步证实，嘌呤代谢过程中关键酶缺陷是引起尿酸生成增多的主要原因，HPRT基因缺陷可导致其活性降低，可使鸟嘌呤核苷酸和次黄嘌呤核苷酸减少，最终导致其终末产物尿酸增加。

1 临床资料

1．1 一般资料

本研究所有病例均为2007～2011年间黑龙江中医药大学附属第一医院风湿科门诊诊断为痛风性关节炎的患者，共78例。其中男性71例，女性7例。正常人外周血样品，取自本院5个健康自愿者。模型组为78例痛风患者治疗前的血样。按随机的原则分为治疗组(痹宁胶囊组)和对照组(秋水仙碱组)，两组病人的一般情况经统计学处理，无显著性差异(P＞0.05)，具有可比性。

1．2 诊断标准

1．2．1 西医诊断标准 参照第7版的《内科》［1］“高尿酸血症与痛风”中的西医诊断标准及孟昭亨编著的《急性痛风性关节炎的诊断标准》［2］。

1．2．2 中医辨证标准 根据前期研究结论及痹宁汤的组方原则，依据《中药新药临床研究指导原则》［3］中《痛风》的中医证型诊断标准，对纳入病例进行湿浊瘀热证的中医证候辨证诊断。

2 方法

2．1 治疗药物 痹宁胶囊主要成分:金钱草15g，山慈菇20g，车前子12g，威灵仙15g，秦艽15g，萆薢15g，土茯苓15g，连翘10g，川芎 12g，忍冬藤 20g，牛膝10g等，规格为0．5g/袋，每袋含生药 0．3mg，每日 3 次，每次4粒，口服。

2．2 对照药物 秋水仙碱片(西双版纳药业有限责任公司)每日2次，每次2片，饭后服。两组患者均连续服药，7天为1个疗程，2个疗程后统计疗效，服药期间禁服高嘌呤饮食、辛辣刺激物、饮酒等。

2．3 主要试剂 PCR引物β－actin长度432bp，HPRT长度653bp;Trizol RNAIsolation;逆转录试剂盒;TaqDNA聚合酶;紫外可见凝胶检测成像系统。

2．4 观测指标 血清HPRT mRNA水平。

2．5 实验步骤 RT－PCR法检测痛风患者血清HPRT mRNA表达，计算提取总RNA量，进行RNA逆转录双链cDNA，运用DNA聚合酶链反应(PCR)扩增cDNA，扩增产物在1．5%琼脂糖凝胶电泳中，电泳分离后在紫外灯下观察并拍照，用VILBER LOURMAT型成像系统进行分析，分别测量HPRT mRNA、β－actin电泳条带的光密度和面积，以HPRT/β－actin比值代表HPRT mRNA表达水平。

2．6 统计学处理

3 结果

3．1 痛风性关节炎患者血清HPRT mRNA电泳条带

如图1、2 结果显示，在琼脂糖电泳凝胶上紫外灯下观察均可见653bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异。各组β－actin电泳条带亮度一致，扩增片段均为432bp。

图1 β－actin mRNA RT－PCR电泳产物

图2 HPRT mRNA RT－PCR电泳产物

3．2 痛风性关节炎患者血清HPRT的mRNA电泳产物灰度扫描值变化 见表1。

表1 HPRT mRNA电泳产物灰度值变化的比较(±s)

表1 HPRT mRNA电泳产物灰度值变化的比较(±s)

注:与模型组相比，★P ＜0．01;治疗组与对照组比较，▲P ＜0．01。

正常组 5 0．8213 ±0．0085★模型组 78 0．1826 ±0．0055治疗组 42 0．8057 ±0．0422★▲阳性对照组 36 0．5835 ±0．0343★

以上结果表明，与正常组相比，两组痛风性关节炎患者治疗前HPRT mRNA表达明显下降(P＜0.01);治疗后两组HPRT mRNA表达比治疗前明显升高(P＜0．01);治疗组与对照组相比，血清HPRT mRNA表达升高的更明显(P＜0．01)。

4 讨论

痛风和高尿酸血症是多基因遗传缺陷性疾病。现已证实，嘌呤代谢过程中关键酶缺陷是引起尿酸生成增多的主要原因，其中磷酸核糖焦磷酸合成酶、磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷属于x伴性遗传，黄嘌呤氧化酶活性增加可能为多基因遗传，我们主要研究尿酸生成增多的相关基因。HPRT是嘌呤代谢补救合成途径中的关键酶，已成为基因突变机制和修复机制理想的研究靶点［4］，HPRT基因缺陷导致其活性降低可使鸟嘌呤和次黄嘌呤转变为鸟嘌呤核苷酸和次黄嘌呤核苷酸减少，两种嘌呤不能被再利用合成核酸而被清除，最终导致其终末产物尿酸增加。本研究从分子水平进一步阐明HPRT基因缺陷可导致尿酸合成增加，而痹宁胶囊能明显改善患者的基因缺陷，减少血尿酸形成，为痛风的早期防治和开发新的药物作用靶点提供科学依据和理论基础。

痛风以脾肾失调，脏腑蕴热为本，以湿热痰瘀浊毒为标［5］。患者禀赋多为湿热之体，再加以嗜酒，喜啖膏粱厚味，致脏腑功能失调，升清降浊无权，积聚之湿热壅滞于血脉中，郁于骨节，又兼因外感风邪侵袭经络，致气血运行不畅，痰湿客于筋骨、肌肉之间［6］。方中金钱草、车前子为君药，有利水通淋，除湿解毒消肿之功，其性甘淡渗利，咸能软坚，微寒清热，通利三焦，长于祛湿，治痹证湿甚者尤佳。威灵仙为臣药，其辛温而散寒，性猛善走，通行十二经脉，既能祛风除湿、舒筋活络，又能止痹痛，同时配秦艽、土茯苓、萆薢、羌活共为臣药祛风湿，清湿热，止痹痛，清虚热。现代药理研究证实，威灵仙煎剂有一定免疫抑制作用［7］，山慈菇既有秋水仙碱样的作用，还有明显抑制血管生成活性和滑膜组织的作用，可用于消除关节的炎症［8－9］。车前子能抑制尿酸合成，金钱草有与双氢克尿噻相似的增强输尿管蠕动和增加尿流量的效应，且两种效应呈平行关系，萆薢、秦艽、土茯苓有利尿作用，从而最终达到降低血尿酸，治疗痛风性关节炎［10－11］。

研究结果表明，基因点突变、插入缺失多态等均可导致该酶活性下降，尿酸合成增加，临床表现为Lasch－Nylan综合征或仅表现为高尿酸血症或痛风。而痹宁胶囊可以显著改善HPRT mRNA表达，使患者血尿酸生成减少，从源头上进行根本性的治疗。

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