活性氧在红花多糖抑制人肝癌SMMC－7721细胞增殖中的作用

孙阳，史默怡，石学魁，王亚贤

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是生物体内一类活性含氧化合物的总称，产生于机体代谢的过程中，对细胞的分化、增殖、凋亡、衰老、癌变以及基因表达都有影响，故而近年来对其研究逐渐深入。ROS对机体作用有着两面性。在氧化应激的状态下，ROS产生过多或清除过少，可致使机体ROS过多，氧化系统和抗氧化系统失衡，导致组织损伤，引起很多疾病。最近的研究发现，肿瘤细胞中ROS升高或氧化还原平衡改变，可由促凋亡信号引起，这可作为凋亡信号转导途径。当凋亡启动后，ROS可进一步促进凋亡的进程。ROS对细胞周期的调控促使ROS升高可以作为抗肿瘤的机制之一。另外，ROS对细胞周期的调控同样起作用，如信号的级联反应、细胞骨架的重组等都与ROS有关［1］。因此，药物如果促使ROS升高可以作为抗肿瘤的机制之一。红花具有活血化瘀的功效，同时具有调节人体免疫力和抗肿瘤的作用［2］。但是对其抗肿瘤的机理研究并不深入。本实验研究红花多糖对人肝癌SMMC－7721 细胞增殖的影响，通过流式细胞仪对ROS进行检测分析，来探讨药物对肿瘤细胞的影响。

1 材料和方法

1．1 实验药品 红花购于哈尔滨益寿堂药店，应用水提纯沉淀法进行红花多糖的提取及纯化［3］。

1．2 主要仪器与试剂 流式细胞仪(BDAira);CO2培养箱(TC2323);倒置显微镜(XDS－1B);Multiskan Mk3 酶标仪;活性氧检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，产品编号:S0033);四甲基偶氮唑蓝(MTT，货号:M2128);二甲基亚砜(DMSO，货号:D2650)。

1．3 细胞及细胞培养 人肝癌SMMC－7721 细胞(武汉博士德公司，编号:CX0296)，取对数生长期的细胞，调密度为1×105个/mL，接种到5mL含有10%热灭活的新生牛血清的RPMI 1640 培养基的培养瓶中，在37℃、体积分数为5%CO2完全饱和湿度条件下常规培养，倒置显微镜下观察细胞生长状况，实验选用对数生长期细胞。

1．4 MTT比色实验 取对数生长期细胞1×104个/mL接种于96 孔板，每孔体积200μL，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下常规培养，使细胞贴壁，呈单层生长。24h细胞贴壁后，吸弃培养液，加入含10%新生牛血清的RPMI 1640 培养液，按实验分组加入不同浓度的红花多糖，每个剂量设6个复孔。加入药物后分别培养24h和48h，每孔吸弃上清液20μL，加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃ 、5%CO2饱和湿度条件下继续孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μL DMSO，避光振荡10min，使沉淀结晶充分溶解，用酶联免疫检测仪于490nm波长检测各孔A值，实验重复3次。按公式计算细胞的生长抑制率(inhibition rate，IR%)。IR=(1－A实验组平均值/A对照组平均值)×100%。

1．5 细胞内 ROS含量的检测 利用荧光探针DCFH－DA对活性氧进行检测。DCFH－DA本身没有荧光，可以自由通过细胞膜，进入细胞后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。DCFH不能透过细胞膜，从而能很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。采用流式细胞仪可以检测出荧光强度，间接反应出细胞内的ROS水平。通过MTT实验，红花多糖分为高、中、低三个剂量组，设定药物作用时间48h。48h后，采用流式细胞仪测定细胞内ROS水平。用PBS液洗涤细胞2次，加入终浓度10μmol/L的DCFH－DA，充分作用，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下孵育20min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞内的DCFH－DA。用500μL PBS液重悬细胞，流式细胞仪分析荧光强度，使用488nm激发波长，525nm发射波长。

2 结果

2．1 SPS对肝癌细胞形态的影响 倒置显微镜下观察SPS作用于SMMC－7721 细胞后其形态的改变。0mg/mLSPS组细胞贴壁生长良好，密集生长，排列均匀，折光性好，大小较一致，形状呈三角形或多边形，增殖旺盛，胞浆丰满。随着红花多糖浓度的增加，贴壁细胞密度降低，细胞间连接消失，细胞数量较对照组明显减少;部分细胞体积增大、胞膜泡状、细胞崩解;部分细胞变圆，体积缩小，细胞皱缩，细胞脱落悬浮于培养基中的数量逐渐增加，细胞周围碎片增多。

2．2 SPS对肝癌细胞增殖的影响 MTT实验结果见表1，不同剂量组SPS分别作用于肝癌细胞24h和48h后，48h优于24h，SPS对细胞的抑制作用明显。各组A值与0mg/mLSPS组A值比较具有统计学意义(P＜0．01)，随着SPS剂量的增加，对SMMC－7721 细胞抑制作用增强。但当SPS剂量为1．28mg/mL时，抑制率却有所下降。说明药物最佳剂量应不超过此剂量。

表1 SPS对肝癌细胞增殖的影响(±s)

表1 SPS对肝癌细胞增殖的影响(±s)

注:与0mg/ml组比较，＊＊P ＜0．01。

0 0．815 ±0．078－0．981 ±0．048 21．510．02 0．801 ±0．059 1．7 0．770 ±0．031＊＊－0．04 0．712 ±0．027＊＊ 12．6 0．689 ±0．027＊＊ 29．770．08 0．689 ±0．029＊＊ 15．5 0．648 ±0．038＊＊ 33．940．16 0．656 ±0．048＊＊ 19．5 0．593 ±0．029＊＊ 39．550．32 0．578 ±0．032＊＊ 29．1 0．528 ±0．032＊＊ 46．180．64 0．492 ±0．026＊＊ 39．6 0．489 ±0．019＊＊ 50．151．28 0．559 ±0．030＊＊ 31．4 0．517 ±0．023＊＊47．30

2．3 SPS对细胞内活性氧的检测 根据MTT实验结果，在 ROS 测定时，选取 0．16mg/mL、0．32mg/mL 和0．64mg/mLSPS(即为高、中、低)三个剂量组分别作用SMMC－7721 细胞48h进行检测。通过流式细胞仪进行检测ROS后，结果如图1 所示，各用药组ROS较空白组有所增加，并随剂量的增加成正相关。说明红花多糖对ROS的增加有促进作用，可能通过此途径来抑制肿瘤细胞增殖。见图1。

3 讨论

研究发现，几乎所有的肿瘤细胞的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性明显低于正常细胞，而这两种酶是细胞清除ROS的主要酶，所以肿瘤细胞对ROS很敏感。化学药物去甲氧柔红霉素诱导白血病和神经母细胞凋亡与细胞内的ROS密切相关。邹少娜［4］等发现，没食子儿茶素没食子酸诱导MGC803 细胞凋亡并发现ROS含量增加。目前，发现的细胞凋亡存在三条途径:线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径。这三条途径经实验证实皆与ROS密切相关。另外，ROS可以调控细胞周期，高氧可以致使细胞在G1、S和G2 期增殖阻滞，细胞增殖受到抑制［5］。

图1 SPS作用48h后ROS的影响

因此，提高肿瘤细胞中的ROS的含量，可以增加药物对细胞的作用，对肿瘤预防和治疗都有着很重要的医学价值。

本实验研究SPS对人肝癌SMMC－7721 细胞的影响。结果，SPS对细胞的增殖具有抑制作用，并可提高ROS的含量。这可能与ROS增多，DNA受到损伤，导致p53 活性被诱导，继而细胞周期蛋白激酶抑制因子表达增加，细胞生长停止于某一阶段，并产生凋亡或死亡［6］。在后续实验中，我们会就此问题进行进一步实验和探讨。

［1］ 成军．现代细胞周期分子生物学［M］．北京:科学出版社，2010:433．

［2］ 石学魁，阮殿清，王亚贤，等．红花多糖的提取与含量测定［J］．中国中药杂志，2010，35(2):215－218．

［3］ 张晓丽，李玉婷，王亚贤，等．红花多糖的提取与含量测定［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16(7):19－21．

［4］ 邹少娜，林敏，伍石华，等．活性氧在EGCG诱导胃癌MGC803 细胞凋亡中的作用［J］．中国癌症杂志，2010，20(5):344－347．

［5］ 余祖撤，毛秉智，从玉文．活性氧与细胞周期调控［M］．军事医学科学院院刊，2007，6(31):576－578．

［6］ Moiseeva O，Mallette FA，Mukhopadyay UK，et al．DNA damage signaling and p53－dependent senescence after prolonged beta－interferon stimulation［J］．Mol Biol Cell，2006，17(4):1583－1592．