葫芦科蔬菜游离小孢子培养研究进展

闵子扬 ，童龙 ，李玲 ，王志伟 ，唐炎英 ，肖璐 ，李涵 ，孙小武 ,3

（1.湖南农业大学，长沙，410128；2.湖南省农科院；3.湖南省瓜类研究所）

葫芦科（Cucurbitaceae）植物包括118个属共825个种，广泛分布于亚热带和热带地区。中国分布约有29个属，142个种，其中大部分是人们喜爱的瓜类蔬菜作物如西瓜（Citrullus lanatus）、黄瓜（Cucumis sativus.L.）、 苦瓜 （Momordica charantia L.）、 南 瓜（Cucurbita pepo L.）等。葫芦科是世界上最重要的食用植物科之一，仅次于禾本科、豆科和茄科，在人们生活中具有重要的作用[1]。

葫芦科植物在常规育种过程中存在育种年限长、难度大、遗传性状不稳定等情况，严重制约了葫芦科植物在生产上的进一步利用。近年来，游离小孢子培养技术的不断成熟，为这一问题的解决带来了曙光。游离小孢子技术研究于20世纪70年代初开始，1982年在芸薹属作物上首次获得成功[2]。小孢子是直接从花药或花蕾中游离出来的天然分散的细胞，具有单倍体和单细胞的特性。游离小孢子培养是指直接培养植物小孢子，诱导小孢子胚胎发生和植株再生，经染色体加倍后直接获得遗传上纯合的双单倍体株系（DH），从而大大简化常规育种中自交纯合程序，缩短育种年限，加速蔬菜新品种选育。近年来，游离小孢子培养已经在大白菜、胡萝卜、青花菜、辣椒、茄子、小麦、大麦等作物上获得了再生的单倍体植株，但是在葫芦科植物上的研究还相对较少，仅在黄瓜[3]和西瓜[4]上获得了胚状体或再生植株。为了总结前人在葫芦科蔬菜小孢子培养上的研究成果，为以后的相关研究提供指导，对葫芦科蔬菜小孢子培养的影响因素进行了综述。

1 供体植株对小孢子胚胎发生的影响

供体植株对小孢子胚胎发生的影响主要体现在植株的基因型、植株生长状况和生长环境、小孢子发育时期等方面。

1.1 基因型

基因型对小孢子培养中胚状体的发生具有决定性作用，不同基因型材料在相同的培养条件下成胚率有很大差异。詹艳等[3]对10份黄瓜的供试材料进行研究发现，只有4份试材获得了胚状体，其中成胚率最高的是“7447”，为每皿31.2个，最低的是“康德”，为每皿1.5个。剩余的6份材料中有些游离小孢子出现膨大，有些已启动分裂，但均未能继续分裂形成胚状体。李娟等[4]在西瓜上的试验发现，野生种和栽培种的成胚率有显著差别，前者要高于后者。缑艳霞[5]和董艳荣[6]分别在西瓜和甜瓜花药培养试验中得出F1代植株的愈伤组织诱导率明显大于亲本，表现杂种优势，说明小孢子的基因型至少是决定培养能力的因素。

1.2 植株的生长状况和环境

供体植株的生长状况和生长环境对小孢子的胚胎发生也有重要影响。有研究表明，如果在小孢子的形成过程中遇到连续的阴雨天气或者是严重的光照不足，小孢子的活力就会严重降低以至于影响小孢子的成胚率。张凤兰等[7]利用人工气候室研究了光照和温度对小孢子胚胎发生的影响，结果表明，光照时数为14 h、温度为20℃时最利于小孢子胚胎的发生，产胚量最高。曹鸣庆等[8]报道生长在日照14～16 h、温度15～20℃条件下的植株在小孢子培养的过程中成胚率最高。供体植株的栽培季节对获得较高活力的小孢子也非常重要，谢淼等[9]利用取自不同季节的黄瓜花药进行小孢子培养，结果发现由于季节的不同，所接种黄瓜花药的诱导率不同，秋季的诱导率低于春季。另外，供体植株的营养状况也是影响小孢子胚胎发生的重要因素，供体植株栽培密度过大则小孢子的成胚率降低[10]。

1.3 小孢子的发育时期

小孢子的发育时期是影响小孢子培养效果的重要因素[11]。花粉小孢子发育可分为四分体时期、单核期、双核期和三核期，单核期又可细分为单核早期、单核中期和单核晚期。因细胞具有全能性，理论上所有时期的小孢子都能发育成为一个完整的植株，但是实际上只有那些处于特定时期的小孢子才能在离体条件下从配子体发育途径经诱导转变为孢子体发育途径，最终形成胚状体。詹艳[12]探究了3份黄瓜材料不同小孢子发育时期对小孢子成胚率的影响，结果表明，只有单核靠边期的小孢子才能诱导成胚。董艳荣[6]关于甜瓜的研究表明，花药培养的最佳时期是单核靠边期到双核期，李娟[4]在西瓜中也有类似报道。目前的研究结果表明，小孢子处于单核靠边期时诱导成胚率都是最高的。

小孢子的发育阶段跟花蕾的外部形态有密切关系，通过对花蕾外部形态如长度、颜色的观察可以大致确定小孢子所处的发育阶段。葫芦科不同植物小孢子培养的最适花蕾长度见表1，但是Turlingn[13]在进行油菜花药培养时曾指出，虽然花蕾大小是判断小孢子发育阶段的可靠指标，但它也随着供体植株的基因型、生长条件、发育阶段和花序等的变化而变化，所以花蕾长度只能作小孢子发育时期的参考指标，具体发育时期还要进一步鉴定。

表1 一些葫芦科蔬菜小孢子培养的最适花蕾长度

2 培养基及其成分对小孢子胚胎发生的影响

培养基的种类和成分对小孢子胚胎发生的影响显著，主要因素为基本培养基的种类、碳源物质种类、培养基中添加的激素种类和浓度以及是否添加活性炭。

2.1 基本培养基的种类

在大多数葫芦科蔬菜小孢子培养中所用的基本培养基都是MS，但是也有一些其他的报道。苏华等[17]研究了B5，MS，Nitsch，N6四种基本培养基对黄瓜花药培养的影响，结果表明，基本培养基中MS对津春3号的愈伤组织诱导率显著低于其他培养基。詹艳等[3]指出在黄瓜游离小孢子培养中，NLN和B5作为基本培养基时获得的胚状体产量差异不显著，但NLN更有利于球形胚进一步发育形成子叶形胚。董艳荣[6]将MS培养基中的Fe-EDTA、Mg2SO4·7H2O和VB1增加一倍得到改良的MS培养基MSKI，用作甜瓜的小孢子培养取得了良好的效果。

2.2 碳源

葫芦科蔬菜游离小孢子培养中使用的碳源和渗透调节剂以蔗糖为主，其类型和浓度对小孢子存活以及胚状体的形成具有很大的影响，不同作物的最适蔗糖浓度有所差别，但以13%最为有利[3，18]。在葫芦科蔬菜小孢子培养时也有一些使用麦芽糖的报道，但是关于这两种碳源到底哪一种更有利于小孢子的培养目前还未见报道，仅陈振光[19]、何艳等[20]在苦瓜的花药培养中得出蔗糖作为碳源比麦芽糖更有利的结论。在十字花科蔬菜的小孢子培养中有在培养初期使用较高浓度蔗糖（17%）以保持小孢子的活力，一定时间（1～4 d）后加液稀释或更换培养基降低蔗糖浓度到10%～14%来促进小孢子分裂可以显著提高胚产量的报道[21]，但这种方法在葫芦科蔬菜上还未见报道，有待进一步研究。

2.3 激素

在葫芦科蔬菜小孢子培养过程中，激素的种类和配比对胚状体的形成起着至关重要的作用。经常使用的激素有生长素和细胞分裂素两大类，前者包括 2，4-D、IAA、NAA 等， 后者包括 6-BA、ZT、KT等。不同植物激素在培养中的作用不同，生长素可以诱导细胞分裂和根的分化，而细胞分裂素则能促使细胞分裂和胚状体的形成。苏华等[17]在关于黄瓜花药培养的研究中指出，对愈伤组织诱导率影响最大的是2，4-D。缑艳霞[5]在西瓜花药培养中同样发现，2，4-D在西瓜花药愈伤组织诱导中起着关键作用，但其质量浓度不宜超过0.5 mg/L。但也有学者指出在瓜类花药愈伤组织的形成过程中，6-BA是一个关键因素。大量瓜类花药培养试验表明，在基本培养基中添加6-BA能显著提高愈伤组织的诱导率，配合2，4-D 和 KT使用效果更好[22]。詹艳[12]在关于黄瓜小孢子培养的试验中把2，4-D和6-BA配合使用，结果发现长春密刺、7447和康德三个黄瓜品种在2，4-D 0.5 mg/mL+6-BA 0.2 mg/mL的培养基上都诱导了胚胎的发生，长春密刺在无外源激素的培养基和浓度较高（2，4-D 1 mg/mL+6-BA 0.5 mg/mL 和 2，4-D 2 mg/mL+6-BA 1 mg/mL）的培养基上虽有胚状体产生但产量显著降低。此试验说明外源激素是小孢子胚胎发生的必要条件，但是所需浓度较低。

2.4 活性炭

关于活性炭在小孢子培养中的作用，Weatherhead和Hensaw指出活性炭能吸附培养基中对小孢子生长发育有一定抑制作用的5-羟甲基糠醛、酚类物质以及杂质等，从而提高出胚率[23]。在十字花科、茄科以及禾本科的小孢子培养中使用活性炭提高小孢子出胚率的报道已经很多，但是也有人指出活性炭在吸附培养基中有害物质的同时也会吸附有益物质如NAA、6-BA等，所以不同试验材料效果可能有显著差异。缑艳霞[5]和喻财铃[24]分别在西瓜和丝瓜的花药培养中发现加入活性炭出胚效果差，有抑制愈伤组织形成的作用。

3 培养技术对小孢子胚胎发生的影响

小孢子的培养技术主要包括花蕾的低温预处理和游离小孢子的高温预培养，其目的主要是从形态上改变其极性分布，从生理代谢上改变其生理状态，从而改变小孢子的发育途径使其由配子体发育途径向孢子体发育途径转变，对培养中能否出现胚状体至关重要。

3.1 花蕾的预处理

在游离小孢子培养中预处理的方法很多，如低温、高温、热激、离心以及甘露醇处理等，在葫芦科中一般使用的预处理方法是低温预处理，处理温度为4℃。针对不同的作物处理的时间有所差别，魏瑛[25]指出，西瓜花药在4℃处理72 h效果最佳；Ashok Kumar[26]等将黄瓜花蕾在4℃和32℃下分别处理1～10 d。结果表明，在4℃条件下处理2 d的效果最佳；董艳荣[6]的研究结果表明，甜瓜花药在4℃条件下处理36 h效果最好；Metwally等[27]指出，南瓜在4℃的最佳预处理时间是4 d。但是也有报道指出，苦瓜愈伤组织的诱导率随着在4℃预处理时间的延长而降低，预处理天数达到4 d时，愈伤组织的诱导率大幅降低[28]。

3.2 游离小孢子的预培养

游离小孢子在进行正常温度（25～28℃）培养之前首先对其进行一段时间的高温预培养是很有必要的，这在十字花科小孢子培养中已经得到证实。高温预培养的时间一般为24～48 h，处理温度因植物种类不同而稍有差异（30～36℃）。有报道指出，与处于25℃恒温条件下培养的小孢子相比，经高温预培养的小孢子在培养前3 d活力会有所降低，但是从第4天开始小孢子的活力显著高于对照[29]。虽然高温预处理在十字花科蔬菜游离小孢子培养中已经得到了广泛的应用，并且取得了很好的效果，但在葫芦科蔬菜作物仅有缑艳霞[5]在西瓜的花药培养中把花药先在30℃条件下培养72 h然后转到25℃条件下培养，发现愈伤组织诱导率显著提高。

3.3 接种密度对成胚率的影响

接种密度与成胚率表现出正相关关系，接种密度过大，小孢子在培养基中竞争养分和空间，不利于小孢子的生长；密度过小促进物质无法形成，也不利于愈伤组织的形成。Duijs等[30]关于小孢子密度对培养效果的研究表明，当小孢子密度在2×104～4×104个/mL时最有利于胚状体的形成。缑艳霞[5]在西瓜花药培养中指出，通常在直径为6 cm的培养皿中接种4个花蕾的20枚花药最为合适。

4 存在问题与进一步研究方向

虽然小孢子培养在育种及生物技术的运用等方面用处很大，但是关于小孢子培养技术的一些机制目前还不是很清楚，只是在十字花科、茄科及禾本科上得到了实际应用，在葫芦科蔬菜上目前还停留在实验室试验阶段。存在的主要问题是小孢子无法启动萌发或者是成胚率太低、不同物种或不同基因型间差异较大、形成的愈伤组织或者是胚状体无法进一步发育成为单倍体植株。在以后的研究中我们要从碳源、生长调节剂的种类和浓度、活性炭的应用、预培养的温度以及时间几个方面入手，争取早日建立成熟的葫芦科蔬菜小孢子培养的植株再生体系，从而使小孢子培养技术在育种以及其他生物技术的应用中发挥积极的作用。

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