不同培养基对水稻花药培养力的影响

查中萍，郭 英，殷得所，胡建林，郑兴飞，董华林，刘艳芳，王红波，薛 莲，徐得泽

（1.湖北省农业科学院粮食作物研究所/农业农村部作物分子育种重点实验室/粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，武汉 430064；2.湖北洪山实验室，武汉 430070；3.湖北省科技信息研究院，武汉 430064）

水稻（Oryza sativaL.）是中国重要的粮食作物之一［1］，肩负着国家粮食安全、满足人们不断提高的消费需求以及农民增收、农业环境可持续发展的第一重任，一直被视为重要的战略物资［2］。水稻花药培养可以快速获得水稻纯系、提高选择效率、缩短育种周期［3］，再生植株双单倍体（DH）系也是分子标记和基因图谱的理想材料。水稻花药培养始于1968 年，日本学者新关（Niizeki）和大野（Oono）利用花药培养技术首次获得水稻单倍体植株［4］，开启了水稻花药培养的先河［5］。1970 年，中国开始研究水稻花药培养，并于1975 年第1 次利用花药培养技术育成粳稻新品种单丰1 号［6］。近年来，随着研究的不断深入，水稻花药培养技术也在逐步完善，并与其他技术相结合应用在遗传育种上，已经成为生物育种技术中相对成熟、实用而且有效的技术［4］。水稻花药培养及单倍体育种，是生物技术在农作物育种中应用最广泛、最有成效的领域［7］。中国开展水稻花药培养及育种应用研究取得了许多成就，花药培养技术不断改进、完善，研究出用于水稻花药培养的培养基有N6［8］、合5、通用、L8、SK3 等［9］；通过花药培养育出中花8 号、中花9 号、花寒早、新秀、朝花矮等优良水稻新品种，已成功在生产上推广应用［10，11］。随着花粉植株性状表现及遗传机理、生理生化研究的深入，花药培养育种相关理论得以不断形成和充实。

本研究以N6、合5、SK3、M8 及改良的M8（简称GM8）培养基为基础培养基，筛选愈伤组织诱导效率高的诱导培养基，设置单一生长调节剂与复合生长调节剂对比试验，以籼稻、粳稻、野生稻为试验材料，广泛而又有重点地选配水稻材料进行花药培养试验，为探索不同培养基的花药培养效果，获得遗传基因型丰富的花药培养后代提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试水稻品种（组合）：X1、HB568（粳稻），JL117、HB613（籼稻），HB570（糯稻）及21ah36（野生稻）。试验于湖北省农业科学院粮食作物研究所南湖试验基地开展，秧龄25～30 d 移栽，水稻的播种、移栽及接种时间详见表1。

表1 水稻播种、移栽及接种时间

1.2 培养基

水稻花药培养基本培养基配方见表2。诱导培养基采用N6［8］、M8［12］、合5［13］、SK3［14］以及GM8 为基本培养基，以MS+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 为分化培养基［3］，诱导培养基配方见表3。

表2 水稻花药培养基本培养基 （单位：mg/L）

表3 水稻花药培养诱导培养基配方 （单位：mg/L）

1.3 水稻花药培养取材及预处理

水稻花药培养取材及预处理参照文献［3］。

1.4 培养条件

将接种花药后的三角瓶放入培养室中进行暗培养，培养温度为26 ℃。待愈伤组织长到直径2 mm左右时转移到分化培养基上，光照诱导器官分化，每天用日光灯补充光照10 h，培养温度为26～28 ℃。

1.5 试验设计

以生育期比较早的X1（粳稻）及JL117（籼稻）为试验材料，利用5 种诱导培养基I1、I2、I2、I4、I5 进行愈伤组织诱导，每种培养基接种40 瓶，每瓶100 枚，即每种培养基接种4 000 枚花药，50 d 后统计愈伤组织诱导情况，统计愈伤组织诱导率。筛选出最佳诱导基本培养基后，对HB613、HB568、HB570、21ah36 4 个品种（组合）进行单一/复合生长调节剂试验。试验设计方案参照文献［3］花药培养方法和文献［15］成熟胚培养诱导愈伤组织配方。

1.6 计算参数及方法

愈伤组织诱导率=愈伤组织数/接种花药数×100%，绿苗分化率=绿苗分化数/愈伤组织数×100%，花药培养力=愈伤组织诱导率×绿苗分化率×100%。

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对愈伤组织诱导率的影响

以X1（粳稻）及JL117（籼稻）为试验材料，X1 诱导20 d 后各培养基陆续有愈伤组织出现，JL117 接种15 d 开始有愈伤组织出现。各基本培养基诱导出愈伤组织的初始时间没有明显差异，但是各基本培养基诱导的愈伤组织的数量有明显不同，接种30 d后，X1 及JL117 在I5 诱导培养基上诱导的愈伤组织数量明显高于其他培养基，且I5 培养基上的愈伤组织大而质地紧密、颜色鲜黄，达到愈伤组织分化培养的条件。接种50 d 后统计愈伤组织诱导率（表4），从表4 可以看出，不同的基本培养基对水稻花药培养效果不同，I5 诱导培养基对籼稻、粳稻的效果都较好，诱导率较高，因此最佳诱导培养基为GM8+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA。

表4 各种诱导培养基对花药培养力的影响

2.2 单一/复合生长调节剂对花药培养力的影响

以GM8 培养基为基本培养基，设置仅添加2，4-D 单一生长调节剂的I6 培养基与复合培养基I5（CK）比较，探讨单一生长调节剂与复合生长调节剂对水稻花药培养诱导力的影响（表5）。从表5 可以看出，无论是粳稻、籼稻、糯稻或野生稻，4 种材料在复合生长调节剂I5 培养基及单一生长调节剂I6 培养基上，都能诱导愈伤组织产生。其中，除HB613在复合生长调节剂培养基上的诱导率高于单一生长调节剂培养基外，其他品种在复合生长调节剂或单一生长调节剂培养基上的诱导率并没有明显差异，甚至单一生长调节剂的诱导率还略高于复合生长调节剂培养基，说明以GM8 为基本培养基，仅添加2，4-D 单一生长调节剂也能够很好地诱导愈伤组织产生。进一步分化试验发现，4 种材料在复合生长调节剂的诱导培养基上，愈伤组织上的绿苗率均高于单一生长调节剂，说明复合生长调节剂能提高花药培养力。

表5 单一/复合生长调节剂对花药培养力的影响

3 小结与讨论

成功的花药培养在一定程度上依赖于培养基的选择，不同的培养基对不同基因型的水稻材料有不同的培养效果，目前研究主要集中在M8、合5 和N6等几种培养基上［16］。本研究采用N6、合5、SK3、M8以及改良的M8 培养基（GM8）为基本培养基对粳稻X1 及籼稻JL117 进行花药培养力研究，结果表明在1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA 的GM8培养基上获得了较高的愈伤组织诱导率，因此GM8培养基是水稻花药培养的最佳基本培养基。

在植物离体培养过程中，外源生长调节剂被认为是植物胚胎发育所必需的［17］。外源生长调节剂可以促进愈伤组织的发生和分化，在水稻花药培养中扮演着重要角色，但研究发现单一成分的生长调节剂培养效果并不理想，而几种生长调节剂的搭配使用却可以在花粉脱分化阶段为组织的分化和成苗提供便利，由此可见水稻花药培养是一个复杂的生理生化过程，使用合理的生长调节剂组分及不同的生长调节剂配比是影响花培效率的重要因素［18，19］。本研究以GM8 为基本诱导培养基，设计了单一和复合生长调节剂配比后，发现单一生长调节剂2，4-D在GM8 基本培养基上对籼稻、粳稻、糯稻及野生稻都有较好的愈伤组织诱导效果。

有研究表明［20-22］，单一生长调节剂培养花药培养力效果较差，复合生长调节剂能明显提高花药培养力。施利利等［23］进行不同生长调节剂的配比组合试验，得出合理添加2，4-D、NAA 和KT 相对于只添加2，4-D 的培养基，不仅出愈率高，而且愈伤质量好。王伍梅等［24］认为，对于粳稻或籼粳交后代诱导生长调节剂仅用2，4-D 是可行的。本研究结果表明，添加复合生长调节剂的培养基虽然没有明显地提高愈伤组织诱导率但绿苗分化率高，即复合生长调节剂配比的培养基对水稻花药培养力较高。