葫芦科主要蔬菜再生体系建立影响因素的研究进展

2018-07-04潘琼玉田丽波商桑黄东梅周萌萌王佳楠邹凯茜

热带农业科学 2018年1期

关键词：蔬菜

潘琼玉田丽波商桑黄东梅周萌萌王佳楠邹凯茜

摘要葫芦科主要蔬菜建立再生体系是基因工程研究中关键性的基础工作。本文就近些年来国内外在激素水平、培养基类型、基因型、苗龄、外植体部位、不同的消毒处理方法等因素对葫芦科主要蔬菜再生体系建立的影响方面的研究进展进行综述，分析了目前葫芦科主要蔬菜再生体系研究进展缓慢的原因，以期为葫芦科主要蔬菜的遗传转化研究和分子育种提供借鉴。

关键词葫芦科；蔬菜；离体培养；再生体系

中图分类号 S432.45 ；Q945.78 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.01.010

Abstract The establishment of regeneration system of Cucurbitaceae was the key job of genetic engineering research. The research development of hormone level， culture medium type， genotype， seedling age and explant site， different disinfection methods and other factors of Cucurbitaceae were summarize， the reason of relatively slow research development of regeneration system of Cucurbitaceae was analyzed， so as to provide reference for the genetic transformation and biotechnology breeding of major Cucubitaceae crops.

Keywords Cucurbitaceae ； in vitro culture ； regeneration system

葫芦科作物在世界分布广泛，有110～122属，775～960种，以热带和亚热带较多，中国有28个属，约150个种，该科植物中有一部分瓜类可作盆栽植物供人观赏，也可作水果蔬菜食用，此外还有一些有独特的药用价值，如苦瓜（Momordica charantia L.）不仅有丰富的营养价值，而且有降血糖[1]、抗菌、抗肿瘤、抗病毒[2]、抗艾滋病等很高的药用功效[3]；甜瓜（Cucumis melo L.）果实口感甘甜，营养丰富，风味独特，是公认的十大健康水果之一；西瓜（Citrullus lanatus （Thunb.） Matsum. et Nakai）有清热解毒、利水消炎的功效，是中国重要的水果类经济作物；南瓜（Cucurbita moschata （Duch. ex Lam.）Duch.ex Poiret）的维生素A含量，与番茄比较不相上下，是非常受欢迎的蔬菜之一。在众多的蔬菜中，黄瓜（Cucumis sativus L.）是最受青睐的蔬菜之一，既可以美容养颜又能清热解毒[4]。

植物的离体再生体系是在人工的条件下，用无菌操作技术使植物组织或单个细胞能够继续生长并分化发育成新的完整植株。植物外植体通过器官发生途径，先经过愈伤组织阶段后分化成再生植株；而通过外植体直接诱导生成不定芽，对于愈伤组织难诱导成苗的物种来说，是一种有效的再生途径，而且还可以缩短植株的培养周期[5]。但葫芦科主要蔬菜不定芽的分化率较低，如甜瓜再生率在44.8%～76.00%[6]，西瓜为83.32%[7]，苦瓜为13.3%[8]，黄瓜为83%[9]，南瓜为27.4%～57.5%[10]，可能受多种因素的影响，其中受基因型和植物内源激素的影响是主要原因。葫芦科蔬菜常规育种的难度大、周期长、遗传性状不稳定，而利用基因工程技术对其进行品质创新和培育出优质高新的品种[11]是一条有效途径。葫芦科蔬菜再生体系的建立是基因工程中转基因植株验证的关键性基础工作，也是目前研究的热点，所以有越来越多的学者展开关于葫芦科蔬菜离体再生体系的研究。本文对葫芦科主要蔬菜离体再生体系建立的研究现状进行概述，主要对影响葫芦科主要蔬菜再生体系建立的因素进行系统分析，为加速葫芦科主要蔬菜的育种工作提供参考依据。

1 培养基和激素水平

植物组培中的一个很重要的条件是植物培养基种类和成分。培养基的成分与植物是否能成功生长有直接关系。生长素和细胞分裂素能很好地促进丛生芽的发生[12]。影响植物愈伤组织形成的一个重要因素是不同的激素组合配比。

1.1 发芽培养基

较为常用的13种培养基为White、MS、B5、SH、N6、NN、DKW、WPM、H、Miller、ER、NT、LS[4]。在大部分植物的组培中，实验人员多采用MS培养基为基本培养基，没有发现专门针对葫芦科植物组培而设计的培养基[13]。MS的无机盐和离子浓度均较高，养分的数量和比例较合适，可满足植物营养和生理需要，且其硝酸盐含量较其他培养基高，可广泛应用于植物器官、花药、细胞和原生质体的离体培养，效果良好，很多培养基是由MS演变而来的。

1.2 BA和IAA、NAA

高浓度的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）不利于丛生芽的伸长，但一定浓度的吲哚-3-乙酸（IAA）和6-BA组合配比对丛生芽的诱导有促进作用[14]。潘绍坤等[15]在研究苦瓜再生植株时发现，加入IAA和吲哚丁酸（IBA）的每个处理的不定芽再生率都很高。王国莉等[16]在2组激素组合MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA和MS+2.0 mg/L 玉米素（ZT）+0.1 mg/L 萘乙酸（NAA）中，3种基因型苦瓜的诱导率都是最高的，每10个外植体得到30个左右的丛生芽。罗燕华[14]以苦瓜子叶节为外植体诱导丛生芽，在培养基为MS+0.2 mg/L IAA+3.0 mg/L 6-BA中，诱导率高达93.8%（表1）。在2.0 mg/L BA+MS和MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IAA 2种培养基中，薄皮甜瓜子叶的再生能力高达100%[17]。有实验表明，培养基中添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IAA時甜瓜的再生率是最高的，当6-BA浓度在1.2 mg/L时芽诱导率最高[7]，但是高浓度的6-BA诱导产生的不定芽染色体会加倍[18]。而有人用甜瓜子叶近胚轴做外植体，选出了最优培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA[19]。BA是诱导西瓜子叶外植体分化必不可少的生长调节剂，诱导子叶丛生芽的BA浓度范围为1～10 mg/L。IAA、IBA、NAA等生长素类生长调节剂常用的浓度范围为0～3 mg/L。有实验证明，2.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA为诱导西瓜丛生芽的最佳培养基[20]。也有实验证明，对西瓜不定芽伸长的作用效果最好的是0.5 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IAA[21]。南瓜愈伤组织诱导最适培养基为MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L BA [22]；南瓜芽分化的最适培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA[23]。而有研究发现，黑籽南瓜丛生芽诱导的最适培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA[24]。黄瓜对生长素非常敏感，诱导大量的愈伤组织只需用极低浓度的生长素。将黄瓜子叶和下胚轴接种于添加1.0～2.0 mg/L BA+0.01～0.02 mg/L IAA（或NAA）的MS培养基中，子叶能直接分化出芽，不同的品种出芽率不同；下胚轴只诱导出愈伤组织，并没有芽的分化[25]。而当6-BA浓度高于1.0 mg/L时，黄瓜丛生芽诱导率会降低，且会出现畸形。

1.3 其他激素

冯锐等[12]单独使用3.0 mg/L激动素（KT）时，苦瓜丛生芽增殖效果为其他激素的4.9倍，且苗健壮，长势好。也有学者用噻苯隆（TDZ）对苦瓜丛生芽进行诱导[26-29]。郑阳霞等[30]的实验表明，TDZ、ZT、6-BA对苦瓜丛生苗的诱导都有一定的促进作用。Tang等[31]发现，单独用BAP能诱导芽分化。Shaik等[32]用CSH和TDZ搭配添加在MS中诱导苦瓜外植体子叶愈伤组织发芽。也有学者用2，4-D对外植体进行愈伤诱导[33-34]。0.01 mg/L IAA和0.2 mg/L KT对西瓜不定芽的伸长率高达97%[35]。在培养基MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L脱落酸（ABA）中黄瓜子叶再生芽诱导率达50%左右[36]。甜瓜叶片的最优愈伤组织诱导培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D，诱导率达90.0%，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L 2，4-D培養基中的出芽率最高，分化率为86.7%[37]。

2 影响不定芽诱导的因素

2.1 基因型

在某些实验中发现，不定芽诱导还会受植物外植体基因型的影响[38]。王国莉等[16]用3个不同基因型的苦瓜进行试验，结果表明在同样的条件下，3个苦瓜的丛生芽诱导率都不一样，但区别不是很大。有实验证明在绿色、黄色、黄绿色3种颜色的愈伤组织中，绿色的分化率最低[30]。最合适子叶节丛生芽诱导时的苦瓜子叶是呈淡绿色的。在西瓜中，黑密5号最容易产生愈伤组织[39]。不同品种甜瓜的不定芽诱导率不同，‘IVF501、‘IVF509、IVF525、‘IVF604的不定芽诱导率分别为88.00%、79.69%、76.50%、74.75%[40]。Todd等[41]用85个黄瓜品种进行再生能力的试验，其中只有28个子叶外植体形成芽，出芽率有较大差异。杜胜利等[42]用不同亲本来源的12个黄瓜进行试验，结果是这12个材料都能诱导产生芽。张卫华等[43]用欧美型HL7、华南型Tm和华北型品系做对比试验，结果显示前2种基因型再生能力都比第三个品系强，可见基因型对黄瓜再生能力还是有一定影响的。

2.2 苗龄和外植体部位

葫芦科主要蔬菜的体细胞发生途径是指由单个细胞或一小团细胞，在特定的培养条件下转为胚性细胞，然后形成球形胚，再经过心形、鱼雷形、子叶等发育期，最后形成再生植株的过程。葫芦科主要蔬菜再生器官的发生一般是通过间接器官发生途径进行的。再生植株培养的间接器官发生途径过程中有比较明显的愈伤组织阶段，如图1所示[44]。

在用外植体直接诱导出丛生芽的阶段，植物苗龄也是不定芽诱导能否成功的重要因素之一[45]。王国莉等[16]用3个不同生长阶段的苦瓜无菌苗进行试验，结果证明，苗龄为10 d左右是诱导子叶节从生芽的最适时期。苗龄为2 d的甜瓜子叶诱导率最高[7]。

不同外植体部位诱导产生的愈伤组织生长速度也存在着差异，这也许是由于作物各个部位激素含量差异导致[46]。罗燕华[14]的试验表明，利用苦瓜的幼叶、胚轴和愈伤组织诱导分化很难，而子叶节却可以直接诱导出丛生芽。真叶、上胚轴等外植体愈伤组织生长速度比较缓慢[41]，而子叶、下胚轴和幼根的愈伤组织生长速度快[47]。在西瓜中，很多组织和器官都能作为西瓜的外植体，比如子叶、茎尖、幼叶、顶芽等，但即使是在同一植株上，其诱导率也存在差异[48]。有学者认为，西瓜子叶是不定芽诱导效果最好的外植体[49]，而万勇等[50]认为，顶芽的诱导率高于子叶。前人研究认为，南瓜愈伤诱导的最适子叶外植体是嫩绿色的[23]。

2.3 温度和光照条件

温度和光照条件对葫芦科外植体的发芽率影响不大，培养温度范围一般为22～28℃，光照为1 000～3 000 lx，光照时长为12～16 h/d。但是在无菌苗初期要经过一段时间的暗处理，待种子露白后再转移到正常的光照条件下。外植体培养初期也要经过几天的暗处理，这样可有效提升外植体不定芽的发生率[51-52]。

3 生根、消毒和移栽

3.1 生根培养

Ganasan等[53]报道了IBA在西瓜组培中的生根效果，0.1 mg/L IBA就能达到100%的促生根效果。武鹏等[8]用MS和1/2 MS作为苦瓜的基本培养基，并在其中分别加入不同浓度梯度的IBA，选出了最佳的生根培养基为1/2 MS+0.2 mg/L IBA。冯锐等[12]的试验表明，在MS中加入0.1 mg/L NAA后，苦瓜生根率达到最高，为100%；在大量元素减半、蔗糖浓度为1%的MS中，生根效果最好，而且，适度降低蔗糖浓度，可以有效控制和改善苦瓜的玻璃化。而郑阳霞等[30]证明了0.05 mg/L NAA促生根效果最佳。苦瓜的再生植株易于生根，在1/2 MS+0.2 mg/L IAA中就能得到比较高的生根率，诱导产生的根形态都比较正常[14]。甜瓜的生根诱导培养基为MS+0.05 mg/L 2，4-D+0.20 mg/L NAA+0.60 mg/L IBA时效果最佳[54]。

3.2 消毒处理

贮藏期长的种子易带菌[14]。武鹏等[8]用3种不同的方法对3组苦瓜种子进行消毒，验证了用10%的次氯酸钠（NaClO4）单独消毒及用0.1%氯化汞（HgCl2）与70%的酒精结合消毒的效果最好。在无菌条件下，用70%的乙醇溶液对甜瓜种子进行消毒1 min，再用8% HgCl2消毒8 min，然后以无菌水冲洗3～5次，这样消毒效果比较好[7]。同样在无菌条件下，可用75%的乙醇溶液对西瓜种子进行消毒30 s，0.1% HgCl2消毒5～6 min，无菌水冲洗3～4次[55]。也有用70% 酒精和3% NaClO4对西瓜种子进行消毒的例子[6]。也可用70%～75%酒精对黄瓜种子消毒3 s，再用4% NaClO4消毒20 min，这也是一种较好的消毒方法[4]。冬瓜种子是用0.1% HgCl2消毒9 min[23]。以上消毒方法都要注意把握消毒时间，时间过长会导致种子受毒害而死亡。

以上几种葫芦科作物消毒药剂都差不多，在试剂浓度上把握好就能安全又有效的做到彻底消毒。

3.3 试管苗的移植

当苦瓜试管苗的根长达到2～2.5 cm时便可以炼苗移栽。每天早晚浇少量水，15 d后统计苦瓜苗的成活率[6-8]。刘冰等[56]认为，待黄瓜长出较多根后，开瓶炼苗3 d，然后移植到含消毒基质的营养杯中保温保湿，大约7 d后可移栽到大棚内。待西瓜的不定根达到2 cm左右，将其从组培瓶中取出，并去掉部分叶片，便可以进行移栽[57]。甜瓜的试管苗长根14 d后可炼苗，5～7 d后便可移栽[58]。南瓜无菌苗平均发根2～3根时便可移栽，浇透1/2 MS营养液培养7 d，试管苗就可以恢复生长[59]。此外，还需注意各种瓜类蔬菜的移栽方式，有些瓜类蔬菜适宜直接移栽，但西瓜就不适宜直接移栽，需通过嫁接才能保证其成活。

综上所述，葫芦科主要蔬菜再生率较低，与组织、器官、苗龄及外植体部位、激素配比、培养基种类和基因型等有关，其中最主要的原因是培养基的激素组合与浓度配比以及葫芦科瓜类蔬菜的基因型。由于植物外植体的各个部位中内源激素浓度不同，所需激素种类和浓度也差异很大。前人研究发现，不同基因型植物诱导出再生芽的难易程度不同，同种植物不同品种间的诱导率差异较大。有些瓜类蔬菜在由愈伤组织诱导再生芽的过程中易出现玻璃化和褐化现象，这也是再生率较低的原因之一。

4 前景展望

葫芦科主要蔬菜是人们日常最重要的蔬菜之一，其重要经济性状和品质性状的改良是当前研究的重点，利用传统的育种方法培育新品种周期长、效率低，而将组织培养和基因工程相结合能快速获得大量特异种质资源和改良目标性状，加速育种进程。建立再生体系可为今后的遗传转化打下基础，对葫芦科主要蔬菜的分子遗传学研究和育种工作都具有重要意义。目前离体培养手段已经用于葫芦科主要蔬菜的品种改良、快速繁殖以及遗传转化，但是还存在着一些问题，比如，虽然应用此手段建立的西瓜、甜瓜、黄瓜中再生体系比较完善，但将此手段应用于其他瓜类中的研究则进展缓慢，离体再生体系建立成功的例子比较少，不定芽再生率低，无法在目標基因的遗传转化验证实验中进行应用，目前多利用拟南芥这种模式植物进行遗传转化验证，但显然这不是最直接的验证手段，今后还需重点探讨影响不定芽分化的主要因素，加强这类蔬菜的不定芽分化与激素水平变化的关系研究，深层次挖掘培养基的成分配比及基因型与不定芽分化之间的关系，探讨葫芦科主要蔬菜不定芽再生的新途径等。

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