不同基因型水稻花药培养效果的比较研究

赵沙沙 潘高峰 陈 波 房振兵 潘秀才 田永宏

（襄阳市农业科学院，湖北襄阳 441057）

花药培养是一种快速获得单倍体植株的常规技术，是产生单倍体植株和创制新的种质资源的重要途径[1-2]。1968 年日本学者新关（Niizeki）和大野（Oono）首次利用水稻花药培养技术获得了单倍体植株[3]。中国于20 世纪70 年代开始水稻花药培养研究，在水稻花药培养技术体系的构建、新的种质资源创制、新品种培育上取得了很大的发展[4]。采用常规育种方法耗时长、效率低，而水稻花药培养技术诱导产生的单倍体，表现出双亲性状的各种重组类型，通过人工处理或自然加倍，在当代就可以获得稳定的二倍体植株[5]，有效缩短育种周期，提高选择效率，加快育种进程[6]。将花药培养技术与常规育种技术相结合，可以快速改良水稻品质、产量、抗病性和生育期等性状，对新品种培育和水稻生产具有重要意义。

水稻花药培养再生体系受材料基因型、生理状态、培养基组分以及培养条件等多个因素的影响，其中，基因型是影响水稻花药培养效率最关键的因素[7]。研究表明，不同基因型水稻的花药培养效率有明显差异，双亲杂交F1的花培效率一般会介于双亲之间而偏向母本。如果双亲的花培效率高，则杂交F1的效率也会较高[8-9]。因此，可以通过筛选基因型，积累具有较高愈伤组织诱导率或者花培效率的水稻材料，组配优异的杂交组合来获取较大量的再生植株群体[3]。目前，水稻花药培养仍有一定的难度，尤其是籼稻花药培养力过低，获得的花培后代群体较小[10]，这与缺乏花药培养再生能力高、综合农艺性状优良的水稻材料有很大关系。从大面积推广应用的水稻品种或具有育种价值的水稻材料中筛选、评价高花药培养力的水稻基因型作为花药培养的材料具有现实性和必要性。

本研究选取常规籼稻、籼粳杂交稻、籼型杂交稻和粳型杂交稻4 种不同类型的水稻材料进行花药培养，比较它们在花药培养过程中的的愈伤组织诱导率和花药培养效果，以期为水稻花培育种提供可以选择的优良基因型。研究对提高水稻花药培养效果、培育花培新品种以及加速水稻花药培养愈伤组织在遗传转化中的应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料选用的试验材料共分为4 类：常规籼稻、籼粳杂交稻、籼型杂交稻和粳型杂交稻，如表1 所示。

表1 不同类型试验材料

1.2 花药培养方法

1.2.1 幼穗取材和低温预处理试验在襄阳市农业科学院团山基地进行。田间选择生长健壮、无病虫害、处于孕穗期的植株，晴天8：00-10：00 取带有剑叶和倒二叶的幼穗。外部形态特征主要表现为：剑叶与倒二叶的叶枕距为8～13cm，苞大而不破，剥开苞叶可见幼穗的颖壳宽度已接近成熟大小，颖壳大多数呈黄绿色，花丝长度为颖壳的1/3～1/2。对田间选取的幼穗镜检时，大多数花粉发育处于单核靠边期（即大孢子发育晚期），此时花药形成愈伤组织的能力最强。将带苞叶幼穗的叶片剪去留叶鞘，用75%的酒精擦拭消毒后用干净的湿润纱布包裹，装入保鲜袋中密封贴上标签，注明材料名称和取样时间等信息，在光照培养箱中8℃条件下进行7～11d的低温预处理。

1.2.2 花药接种用75%的酒精对预处理后的稻穗表面进行消毒，然后在超净工作台上剥除叶鞘，选取合适的带枝小穗，置于50mL 离心管中，加入75%酒精浸泡1min 后倒掉，用无菌水冲洗1 次，然后加入新配制的3%次氯酸钠溶液完全浸没小穗，放在涡旋振荡仪上振荡25min，倒掉次氯酸钠溶液用无菌水冲洗4～5 次，再用无菌滤纸吸干水分。在无菌条件下用剪颖抖药法将花药接种至诱导愈伤培养基上，每个组培瓶接种100～200 个花药，在组培瓶上注明接种材料和时间，每个处理3 次重复。在26～28℃的黑暗条件下培养，接种30～60d 内统计愈伤组织诱导率。

1.2.3 愈伤组织分化及壮苗将已长出的约1.0～2.0mm、淡黄紧凑的新鲜愈伤组织转移到分化培养基上，先暗培养3d，然后在26℃、1000～l500Lx、10～12h/d 光照条件下分化培养。在转分化后30～40d内统计绿苗分化率和白苗分化率。

待绿苗长至高3～5cm 时，将其转移至生根培养基中生根。培养约7d 后，小苗开始生根，20d 左右小苗根长达1.5～2.5cm，打开瓶盖炼苗，3d 后洗干净培养基，移栽到大田进行常规管理。

1.3 培养基诱导愈伤培养基、分化培养基和生根培养基分别按照表2 进行配制，pH 值均为5.7～5.9。

表2 所用培养基配方

1.4 数据统计与分析用Microsoft Excel 整理数据，计算愈伤诱导率、绿苗分化率、白苗分化率以及花药培养力，以确定试验材料花药培养力（绿苗产率）的大小。试验数据用SPSS23.0 统计软件进行单因子方差分析以及相关性分析。计算公式如下。

愈伤诱导率（%）=诱导出的愈伤组织块数/接种总花药数×100

绿苗分化率（%）=分化出绿苗的愈伤组织块数/接种愈伤组织总块数×100

白苗分化率（%）=分化出白苗的愈伤组织块数/接种愈伤组织总块数×100

花药培养力（%）=愈伤诱导率×绿苗分化率×100

2 结果与分析

2.1 常规籼稻花药培养效果常规籼稻的花药培养效果如表3 所示，其愈伤组织诱导率为0.18%～3.01%，禾香1 号的愈伤组织诱导率最高，福稻88的愈伤组织诱导率最低，不同材料之间的愈伤组织诱导率存在差异，有些材料间差异达显著水平。根据愈伤组织诱导率将不同材料分为容易诱导类、较易诱导类和较难诱导类，禾香1 号和福稻99 的愈伤组织诱导率超过1%，显著高于其他材料，为容易诱导类；粤禾丝苗和农香24 的愈伤组织诱导率超过0.5%，为较易诱导类；黄华占、华占和福稻88 的愈伤组织诱导率低于0.5%，属于较难诱导类。所有材料诱导出的愈伤组织均未分化出绿苗。

表3 不同籼稻材料花药培养的愈伤组织诱导率比较

禾香1 号是地方常规籼型高档优质稻品系，米质优；福稻99 是湖北省近几年自主选育并通过审定的籼型常规水稻品种，综合性状好，花药培养又相对容易，是进行水稻花培育种的优良亲本，可以选择优缺点互补、综合性状好的亲本与它们配制优异的杂交组合进行花药培养以创建DH（Doubled haploid，即双单倍体）群体。

2.2 籼型杂交稻花药培养效果玉晶91 作为亲本组配的F1杂交组合的花药培养愈伤组织诱导率为0.19%～1.79%，玉晶91/农香24 最高，玉晶91/玉针香最低，组合间差异显著（表4）。组合玉晶91/农香24 和玉晶91/鄂中5 号的愈伤组织诱导率均超过1%，显著高于玉晶91/玉针香，容易诱导出愈伤组织。鄂中5 号/禾香1 号的愈伤组织诱导率为1.38%，也容易诱导出愈伤组织。所有材料诱导出的愈伤组织均未分化出绿苗。

表4 不同籼型杂交稻花药培养的愈伤组织诱导率比较

以玉晶91 组配的F1杂交组合的愈伤组织诱导率除了玉晶91/玉针香外均较高，表明玉晶91 与某些亲本间具有较好的杂种优势和花药培养配合力，而玉针香的愈伤组织诱导率可能较低，所以配制的F1杂交组合诱导率也较低。以愈伤组织诱导率高的禾香1 号为父本，组合鄂中5 号/禾香1 号诱导率也比较高，表明作为亲本之一的愈伤组织诱导率高，F1杂交组合愈伤组织诱导率可能也比较高。

2.3 籼粳杂交稻和粳型杂交稻花药培养效果水稻含粳稻基因的杂交稻愈伤组织诱导率、绿苗分化率、白苗分化率、花药培养力如表5 所示。不同基因型愈伤组织诱导率存在差异，香1 号/17J42 的愈伤组织诱导率最高，可以达到79.59%（图1-A），组合圣稻18-15//春江041/武运粳24 的愈伤组织诱导率最低，为7.68%。供试材料的绿苗分化率为2.05%～27.03%，组合圣稻18-15//春江041/武运粳24 绿苗分化率最高，为27.03%，其次为甬优1526和甬优2640，均超过10%。供试材料花药培养白化现象严重，除了组合圣稻18-15//春江041/武运粳24 外，甬优2640、甬优1526、香1 号/17J42 和中浙粳18/鄂香2 号4 个材料的白苗分化率均高于绿苗分化率。供试材料的花药培养力为1.40%～3.60%，甬优2640 的花药培养力显著高于其他材料，中浙粳18/鄂香2 号最低。

表5 水稻粳型材料花药培养效果比较

总的来看，甬优1526 形成的白苗分化率较高，组合圣稻18-15//春江041/武运粳24 的愈伤组织诱导率较低，中浙粳18/鄂香2 号和香1 号/17J42虽然容易诱导愈伤组织，但形成的愈伤组织质量很差，绿苗分化率较低，以上均不适合作为水稻花药培养育种的材料。甬优2640 的愈伤组织诱导率和绿苗分化率均较高，可以作为水稻花药培养育种的材料（图1-B，C，D）。

图1 部分水稻粳型材料花药培养愈伤组织诱导和分化情况

相关分析表明，供试材料的愈伤组织诱导率、绿苗分化率、白苗分化率和花药培养力两两之间相关不显著。

3 结论与讨论

本研究对4 种不同类型的水稻进行花药培养，结果表明花药培养效果在基因型间有显著差异，与前人研究结果大致相同。常规籼稻禾香1 号和福稻99 愈伤组织诱导率高，可作为水稻花培育种的优良亲本。以玉晶91 为亲本配制杂交组合并进行花药培养，结果表明玉晶91 与某些亲本间具有较好的杂种优势和花药培养配合力，在水稻花培育种中具有一定的潜在利用价值。禾香1 号愈伤组织诱导率高，组合鄂中5 号/禾香1 号也较高，表明作为亲本之一的愈伤组织诱导率高，F1杂交组合愈伤组织诱导率可能也比较高。含粳稻血缘的杂交稻中，甬优1526、圣稻18-15//春江041/武运粳24、中浙粳18/鄂香2 号和香1 号/17J42 均不适合作为水稻花药培养育种的材料。甬优2640 的花药培养愈伤组织诱导率和绿苗分化率均较高，可以在水稻花培育种和DH 群体创建中加以利用。相关性分析表明，供试材料的愈伤组织诱导率、绿苗分化率、白苗分化率和花药培养力两两之间相关不显著。

水稻材料（即基因型）对水稻花药培养效果的影响最重要。一般认为，花药培养力的大小为糯稻>粳稻>籼粳杂交稻>籼型杂交稻>籼稻，同一类型的不同品种之间差异也较大[11]。目前花培育种常用的方法是在综合农艺性状优良的水稻品种（系）中，筛选出较高培养力的水稻材料配制优异的杂交组合来进行花药培养。

供试水稻材料在花药培养过程中白化现象严重，大部分材料的再生白苗均比再生绿苗要多。可能受到取材时期、培养基成分和培养条件等因素的影响，在愈伤组织分化阶段通常会产生大量的白化苗。已有不少报道表明，花药的生长状态和培养条件均可以影响白化苗的产生。在诱导培养基中，适当降低锰的含量和无机盐浓度，2，4-D、KT 或者NAA 的激素配比要适量[12]，既能提高愈伤组织诱导率，同时又能降低白苗分化率。在愈伤组织诱导和分化阶段，在不影响正常生长的前提下降低温度，减少光照也可以降低白苗分化率[12]。

开展水稻花药培养育种工作对亲本选配具有很高要求，不仅要求双亲品质优良、产量高、抗病性强、优缺点互补，而且双亲之一要具有较高的愈伤组织诱导率或者花药培养配合力，这是提高水稻花培育种效率的关键。影响水稻花药培养效率最重要的因素是基因型。籼稻花药培养力一般偏低，愈伤组织诱导率只有0.5%，一般不超过5%，有些材料甚至不能诱导出愈伤组织[13]。为了提高籼稻花药培养效率，可以通过筛选基因型，积累花药培养力高的水稻材料，然后与另一个综合性状优良的亲本配制杂交组合进行花药培养来获取较大量的花培后代群体。还可以把花药培养力高的基因通过杂交、回交等手段导入到优良亲本或者杂交材料中，改善花药培养的遗传背景来获取较大量的单倍体植株[11]。因此，从大面积推广应用的水稻品种或具有育种价值的水稻材料中筛选、评价高花药培养力的水稻基因型作为花药培养育种的材料，对新的种质资源创制、DH 群体构建和进行花培育种具有十分重要的意义。