JNK信号通路介导高糖诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖

刘丽华，房彩霞，邓永贵，周 红

(河北医科大学第二医院内分泌科，河北石家庄050000)

心肌纤维化是糖尿病心肌病的主要病理改变之一，是由于心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖和细胞外基质过度分泌和堆积的结果，最终导致充血性心力衰竭，这与糖尿病病人心血管疾病的高发病率和高病死率密切相关。目前尚无更有效的药物来防治糖尿病心肌病。抑制CFs增殖是抑制心肌纤维化的主要作用环节。已经证实高糖能够诱导CFs增殖［1－2］，但其分子机制尚不十分清楚。已有研究发现C-JUN氨基末端激酶(C-JUN N-terminal kinase，JNK)信号通路在多种细胞生长因子致纤维化过程中起到关键性作用，并与其他信号通路存在着交互影响。本研究揭示JNK通路在高糖诱导CFs增殖中的作用，为糖尿病心肌病提供新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级出生3d的Sprague-Dawley乳鼠，雌雄不限，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号:SCXK(冀)2008-1-003。JNK抑制剂SP600125(德国默克公司);DMEM培养基(含5.5 mmol/L葡萄糖和25 mmol/L葡萄糖)和新生胎牛血清(Gibco公司);胰蛋白酶和MTT(Sigma公司);胶原酶Ⅱ和Trizol(Invitrogen公司);Taq Master Mixe和M-MLV反转录酶(Promega公司);小鼠抗大鼠波形蛋白抗体，纤维素抗体和平滑肌肌动蛋白抗体工作液(北京中衫生物技术公司);兔抗大鼠磷酸化JNK(p-JNK，183/Y185)抗体(Cell Signaling公司);兔抗大鼠JNK1/2(T178)抗体(Bioworld公司);兔抗大鼠β-actin和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗体(Santa Cruz公司)。C-JUN引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养:取新出生3 d的Sprague-Dawley大鼠心室组织，用预冷的 D-Hanks液洗净残血，将心室剪碎，大约1 mm×1 mm×1 mm组织块，洗去血细胞。用0.125%胰蛋白酶+0.04%胶原蛋白酶Ⅱ连续消化成单细胞悬液，整个消化过程在37℃恒温条件下进行。分别收集各次消化上清液，加等量10%胎牛血清低糖DMEM培养基(5.5 mmol/L葡萄糖)，以1 200 r/min离心5 min，弃上清液。重复2次。离心管中加入10%胎牛血清低糖DMEM培养基，用吸管吹打沉淀，将细胞悬液经200目细胞筛过滤后接种于100 mm2的培养皿中，置37℃、5%CO2培养箱内培养。90 min后弃培养液，采用差速贴壁去除未贴壁心肌细胞。加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养2～3 d，细胞生长至汇合状态时，按1∶2传代，实验应用2～3代细胞。倒置显微镜下观察CFs的形态学特征，并应用免疫细胞化学染色法进行鉴定。

1.2.2 MTT法测定细胞增殖:取对数生长期CFs接种于96孔板中，每孔 CFs 5×103个(100μL/孔)。37℃、5%CO2及饱和湿度下培养24 h后，换0.1%胎牛血清培养基，使细胞同步化24 h。吸弃各孔培养基，分为高渗组(OSM:含5.5 mmol/L葡萄糖 +19.5 mmol/L甘露醇)，对照组(NG:含5.5 mmol/L葡萄糖)，高糖组(HG:含25 mmol/L葡萄糖)，HG+SP600125组(10、20μmol/L)，每组设6个复孔。应用0.1%胎牛血清DMEM培养基继续培养48 h。培养结束前4 h，每孔中加入5 g/L的 MTT 20μL，置37℃继续培养4 h后终止，吸弃孔内培养上清液，每孔加入100μL DMSO，振荡15 min后，在酶联免疫检测仪上490 nm处测定吸光度值(A490值)。

1.2.3 Western blot测定蛋白表达:取对数生长期CFs接种于6孔培养板中(2×105个/孔)，应用不同糖浓度(12、18和25 mmol/L葡萄糖)刺激48 h后收集细胞;并且在高糖(25 mmol/L葡萄糖)下刺激不同时间(12、24和48 h)收集细胞;以及按上述分组后培养48 h收集细胞。分别将这些细胞用预冷PBS洗涤细胞 2次，加入1 mL蛋白裂解液，12 000 r/min，离心10 min。吸取上清液采用 BCA法测定总蛋白含量。取20μg蛋白加样至10%SDSPAGE凝胶电泳，之后转移到PVDF膜上。膜在室温下用5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，用抗JNK，抗p-JNK，抗PCNA和抗β-actin抗体在4℃孵育过夜，冲洗。然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液显影。应用凝胶图像分析系统进行吸光度扫描。JNK磷酸化水平以p-JNK与JNK的吸光度比值表示，PCNA蛋白表达以其与β-actin吸光度比值表示。

1.2.4 RT-PCR测定C-JUN基因表达:取对数生长期CFs接种于6孔培养板中，分组后培养48 h收集细胞。用Trizol提取总RNA，用分光光度计来测定其纯度。取5μg RNA在M-MLV反转录酶作用下合成单链的cDNA;取5μg反转录产物进行PCR扩增。C-JUN上游引物为5'-AATGGGCACATCACCAC TACAC-3'，下游引物为5'-CGTCTGCGGCTCTTCCTT CA-3';产物大小为450 bp。GAPDH上游引物为5'-GATGGGTGTGAACCACGAGAAA-3'，下游引物为5'-ACGGATACATTGGGGGTAGGAA-3';产物大小为330 bp。C-JUN的反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s;61℃退火30 s;72℃延伸30 s;30个循环。GAPDH的反应条件:预变性和变性同C-JUN，55℃退火30 s;72℃延伸30 s;28个循环。取8μL扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳;凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，结果以C-JUN与GAPDH吸光度比值表示。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差表示，应用单因素方差分析及Student-Newman-Keuls'检验进行组间的两两比较。

2 结果

2.1 CFs的鉴定

倒置显微镜下可见CFs呈梭形，胞质透明，胞核较大，呈椭圆形，通常含2～3个核，无自发性搏动。锥虫蓝测定细胞活力，活细胞率达98%。抗波形蛋白、纤维连接蛋白染色呈阳性;抗α-平滑肌肌动蛋白染色阴性，符合上述条件即鉴定为CFs，纯度达95%(图1)。

2.2 高糖和SP600125对CFs增殖的影响

与对照组比较，高糖组吸光度显著增高(p＜0.01)。HG+SP600125(10，20μmol/L)组吸光度较高糖组分别降低了12.7%(p＜0.05)和21.8%(p＜0.01)(图2B)。

2.3 高糖和SP600125对JNK活性和PCNA表达的影响

将细胞暴露于25 mmol/L高糖中，与对照组比较，不同的刺激时间均显著地增加p-JNK，而总JNK无显著变化，p-JNK/JNK显著增加(p＜0.05，p＜0.01)(图3A)。从糖浓度分析，与对照组比较，不同的糖浓度均显著地增加JNK磷酸化(p＜0.05，p＜0.01)，且表现出浓度依赖性(图3B)。高糖也显著增加了PCNA蛋白表达(p＜0.01)。在高糖刺激的细胞中加入SP600125(10，20μmol/L)与高糖组比较则显著地抑制了高糖诱导的JNK磷酸化的增加(p＜0.01)(图4A)及PCNA蛋白表达的上调(p＜0.01)(图2A)。

2.4 高糖和SP600125对C-JUN基因表达的影响

与对照组比较，高糖显著上调了C-JUN基因表达(p＜0.01)。在高糖刺激的细胞中加入SP600125(10，20μmol/L)，与高糖组比较能够显著抑制高糖诱导的C-JUN基因表达的上调(p＜0.01)(图4B)。

图1 心肌成纤维细胞免疫化学染色特征Fig 1 The features of immunocytochemical staining in CFs(×400)

3 讨论

CFs占心脏中非心肌细胞的90% ～95%，是合成胶原的重要细胞，也称为心肌纤维化的主要效应细胞，心肌纤维化在糖尿病心肌病的形成中起着重要作用［3］。本研究探讨了高糖对CFs增殖的影响，发现在高糖环境中CFs增殖加速，这与国外的许多报道一致［1－2，4］。单纯高渗透压对CFs增殖没有影响，提示只是高糖而不是渗透压的改变刺激了CFs增殖。

图4 高糖和SP600125对JNK活性和C-JUN mRNA表达的影响Fig 4 The effects of HG and SP600125 on JNK activity and expression of C-JUN mRNA in CFs(，n=6)

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPKs)是细胞膜信号向核信号传递的枢纽，主要包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)、JNK、P38 MAPK，调节着细胞的生长、分化、发育以及凋亡等一系列行为和功能。文献报道［4－5］高糖能够刺激成纤维细胞上ERK1/2和P38 MAPK通路，但高糖与JNK通路的关系尚未见报道。通常ERK1/2通路调节细胞的增殖和分化，而JNK和P38 MAPK调节应激反应、细胞生长停滞和凋亡。但新近的研究［6－8］显示 JNK是纤维化过程的重要调节者，甚至在细胞增殖中JNK的激活比ERK1/2更为重要。作为JNK的下游靶点，C-JUN是多种基因的转录因子，这些基因的过度表达与细胞周期和细胞增殖密切相关［6，9］。已有研究表明JNK的激活包含在了心肌纤维化的形成机制中［10］。本研究显示高糖能够以时间和浓度依赖性地激活JNK1/2，使得其下游的C-JUN表达增加。JNK抑制剂SP600125不但抑制了JNK的活性，而且抑制了PCNA的表达和CFs增殖。这些结果表明JNK信号通路部分地参与了高糖诱导的CFs增殖过程。虽然以往的研究［11］表明JNK通路也可能被高渗透压激活，但本研究显示高渗透压对JNK通路没有影响，这可能与研究中所选择的渗透压增高程度和细胞系种类有关。

本研究结果提示JNK通路在高糖诱导CFs增殖中起着重要作用，抑制JNK通路有可能阻止糖尿病心肌纤维化的发生、发展，这些还需要进一步在体研究所证实。

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