siRNA干扰人BMP9重组腺病毒载体的构建及其促进乳腺癌SK-BR-3细胞增殖

刘月红，王 科，孙笑笑，万绍恒，王 维，陈莹莹，张 彦*

(1.重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆400016;2.重庆医科大学附属永川医院检验科，重庆402160)

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是一组可诱导骨形成的生长因子，可调节细胞的生长、分化、转移等。BMP9目前被认为是BMPs家族成骨作用最强的因子，近年来发现，BMP9在大多数肿瘤中均有异常表达而成为新的研究热点［1］。本实验前期研究发现乳腺上皮细胞HBL-100和低转移乳腺癌SK-BR-3细胞高表达BMP9，中度转移乳腺癌MCF-7细胞有较高BMP9的表达，而高转移乳腺癌MDA-MB-231细胞无BMP9的表达;体外实验证明，外源性BMP9可有效抑制MDA-MB-231细胞的增殖［2］、迁移和侵袭能力［3］，阻滞其细胞周期在 G2/M期促进细胞凋亡［2］。那么内源性BMP9的高低是否与肿瘤的恶性程度相关，BMP9在肿瘤发生发展中具体分子机制如何均有待进一步研究。由于沉默靶基因是研究分子机制的一个重要途径，故本实验构建AdsiBMP9腺病毒并检测沉默内源性BMP9对SK-BR-3细胞增殖能力的影响，为进一步研究人BMP9基因提供重要的依据和分子手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系、菌株和质粒:Pses-Hus、pAdEasy-1质粒和乳腺癌SK-BR-3细胞(美国芝加哥大学医学中心分子肿瘤研究室馈赠)。DH5α、BJ5183菌种、乳腺上皮细胞HBL-100以及HEK293细胞(重庆医科大学医学检验系分子医学实验室)。

1.1.2 主要试剂:Trizol和脂质体转染试剂盒(Invitrogen公司);高糖型DMEM培养基和胎牛血清(Hyclone公司);试验中所用引物，普通 PCR和DNA连接试剂盒(大连宝生物技术有限公司);限制性内切酶PmeⅠ和PacⅠ(New England Biolab公司);DNA纯化试剂盒(Omega公司);兔抗β-actin(sc-47778)、羊抗BMP9(sc-27821);MTT试剂(Solarbio公司)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA干扰质粒的制备及鉴定:针对人BMP9基因mRNA序列(NCBI Reference Sequence:NM_016204.1)，通过RNA干扰在线设计软件设计3对针对人BMP9的干扰序列，同时设计阴性对照(negative control，NC)序列(表1)，通过 BLAST 同源性分析，排除阴性对照序列非特异性抑制其他基因的可能。4对序列的两端均添加黏性末端A…TTTT后送公司合成。合成的4条片段分别命名为siBMP9-1、siBMP9-2、siBMP9-3 和 siNC。SfiⅠ酶切Pses-Hus质粒经纯化试剂盒纯化后分别与4条片段连接，连接产物经乙醇沉淀电转入DH5α菌，卡那霉素抗性筛选单克隆，提取质粒，5μL酶切鉴定，5μL送大连宝生物工程有限公司测序。鉴定正确的干扰质粒分别命名为 Pses-Hus-siBMP9-1、Pses-HussiBMP9-2、Pses-Hus-siBMP9-3和 Pses-Hus-siNC。

表1 siBMP9和siNC引物序列Table 1 The sequence of siBMP9 primer and siNC primer

1.2.2 脂质体转染筛选有效干扰质粒:按Invitrogen公司的Lipofectamine2000转染试剂说明书操作。取对数生长期 HBL-100细胞，以3×105个/孔接种于6孔板，置37℃培养。待细胞融合率达80%～90%时，换为无血清无双抗DMEM培养液，分 别 用 Pses-Hus-siBMP9-1、Pses-Hus-siBMP9-2、Pses-Hus-siBMP9-3和Pses-Hus-siNC质粒转染HBL-100细胞，37℃培养6 h，之后换新鲜的含10%FBS的DMEM培养液继续培养36 h。由于穿梭质粒Pses-Hus本身表达红色荧光蛋白(RFP)，在荧光显微镜下观察RFP的表达情况，以确定转染效率。Trizol法提取细胞总RNA，取2μg总RNA反转录合成cDNA，以1μL cDNA为模板进行PCR反应。BMP9上游引物:5'-CTGCCCTTCTTTGTTGTCTT-3'，下游引物:5'-CCTTACACTCGTAGGCTTCATA-3'，产物长度322 bp。内参GAPDH上游引物5'-CAGCGACACC CACTCCTC-3'，下游引物:5'-TGAGGTCCACCACCCT GT-3'，产物长度120 bp。PCR条件:预变性94℃5 min，变性94℃ 30 s，退火52 ℃ 30 s，延伸72℃30 s，33个循环。最后72℃ 10 min。取 PCR产物5μL行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，置于GEL EQ凝胶成像仪上成像，用Quantity One软件进行结果分析，以BMP9条带吸光度值/内参照条带吸光度值的比值表示BMP9 mRNA的相对表达量。筛选干扰效果最好的一组 RNAi质粒，将其命名为 Pses-HussiBMP9。实验重复3次。

1.2.3 siRNA干扰人BMP9重组腺病毒的构建:将筛选的有效干扰质粒(Pses-Hus-siBMP9)和阴性对照质粒(Pses-Hus-siNC)在BJ5183大肠杆菌中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1重组获得腺病毒质粒pAdsiBMP9和 pAdsiNC，将 pAdsiBMP9和 pAdsiNC经PacⅠ酶切后分别转染HEK293细胞，2 d后倒置荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达。继续培养14 d，于1/3～1/2细胞变圆漂浮并有明显的细胞病变时离心收集细胞，1 mL PBS重悬细胞，－80℃/37℃反复冻融4次，离心取上清，反复感染HEK293细胞获得大量病毒(AdsiBMP9)，纯化并利用逐孔稀释法测定病毒滴度。

1.2.4 AdsiBMP9感染SK-BR-3细胞后基因沉默效果鉴定:分别用AdsiBMP9和AdsiNC腺病毒感染SK-BR-3细胞，做为实验组和阴性对照组，并设置空白组，病毒感染后36 h提取各组细胞的mRNA，反转录成cDNA模板，BMP9的引物进行PCR扩增，同时做GAPDH为内参平行管，做吸光度值的比较(方法同1.2.2)。同上设置3组，提取各组细胞的总蛋白，取等量蛋白上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜，5%小牛血清封闭1～2 h，加入一抗(BMP9:1∶500;β-actin:1∶5 000)，4 ℃ 过夜;洗膜，加入biotin标记的二抗，室温30 min;再次洗膜，加入Streptavidin-HRP，室温20 min，ECL 发光。Image pro plus 6.0软件分析灰度值。实验重复3次。

1.2.5 MTT法检测AdsiBMP9对乳腺癌SK-BR-3细胞增殖的影响:取对数生长期SK-BR-3细胞，以1×104～3×104个/mL的浓度(保证细胞5 d生长状态良好)接种于96孔板中，每孔100μL单细胞悬液，设AdsiBMP9感染组，AdsiNC阴性对照组，空白组3组，每组设5个平行孔，待细胞贴壁后，分别向感染组和阴性对照组每孔加入滴度均为1×1010IU/mL的 AdsiBMP9和 AdsiNC腺病毒0.1μL，空白组每孔加入等量的PBS，37℃常规培养，8～12 h后换成含1%胎牛血清的高糖型DMEM培养基继续培养。细胞培养1～5 d后分别进行MTT检测，检测前更换为无血清RPMI1640培养基，100 μL/孔，加入 MTT(5 g/L)溶液20 μL/孔，继续培养4 h;吸尽孔内培养液，加入150μL/孔DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上波长492 nm处检测各孔的吸光度(A)值。实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。所测数据均以均数±标准差()表示，采用t检验进行统计。

2 结果

2.1 构建针对人BMP9的RNAi质粒并在HBL-100细胞中筛选有效RNAi质粒

3种干扰质粒和阴性对照质粒的测序结果与所设计的siRNA序列完全一致。采用脂质体转染方法将4种质粒转染HBL-100细胞，36 h观察各组均有红色荧光表达，感染效率均约60%(图1)RT-PCR显示siBMP9-1、siBMP9-2和siBMP9-3组细胞BMP9 mRNA的表达较siNC组均有所降低(图2)，分别降低了53.13%、48.35%和37.19%。可见Pses-HussiBMP9-1的干扰效果较 Pses-Hus-siBMP9-2、Pses-Hus-siBMP9-3更明显，故选定Pses-Hus-siBMP9-1作为有效干扰质粒(Pses-Hus-siBMP9)继续包装成腺病毒。

图1 脂质体转染后细胞的红色荧光表达情况Fig 1 The red fluorescent expression after transfected interference plasmid(×100)

图2 RT-PCR检测各组细胞中BMP9 mRNA的表达及相对抑制率Fig 2 The expression of BMP9 mRNA in different groups detected by RT-PCR and relative inhibitory rate

2.2 重组腺病毒AdsiBMP9和AdsiNC的构建

重组腺病毒质粒 pAdsiBMP9和 pAdsiNC经PacⅠ酶切可见4.5 kb的小片段和大约30 kb的大片段(图3)。转染HEK293细胞后2 d可见20%红色荧光，7 d后可见满天星样红色荧光，14 d后可见云雾状病毒扩增(图4)细胞变圆，可见病毒空斑形成。收集病毒液，反复感染HEK293细胞获得大量病毒，最终得到滴度为1×1010IU/mL的重组腺病毒。

图3 重组质粒pAdsiBMP9和p AdsiNC的PacⅠ酶切产物电泳图Fig 3 Restriction map of recombinant plasmid pAdsiBMP9 and p AdsiNC with PacⅠ

2.3 RT-PCR、Western blot检测AdsiBMP9对BMP9的沉默效果

各组SK-BR-3细胞的GAPDH表达基本一致，空白组和AdsiNC组BMP9 mRNA表达基本一致，而AdsiBMP9组能显著抑制BMP9 mRNA的表达，抑制率为58.27%。各组间总蛋白上样相同的情况下，空白组和AdsiNC组的BMP9蛋白表达量基本一致，而AdsiBMP9能显著抑制BMP9的蛋白表达，抑制率为51.63%(图5)。

2.4 腺病毒AdsiBMP9干扰BMP9后促进SK-BR-3细胞增殖

腺病毒处理后第4天SK-BR-3/AdsiBMP9组较SK-BR-3/AdsiNC组细胞增殖率明显升高(p＜0.05)，而SK-BR-3组与SK-BR-3/AdsiNC组无明显差异;第5天，SK-BR-3/AdsiBMP9组的细胞增殖率显著高于SK-BR-3/AdsiNC组(p＜0.05)，而SK-BR-3组和SK-BR-3/AdsiNC组细胞增殖情况无显著差异(图6)。

3 讨论

图6 重组腺病毒AdsiBMP9对乳腺癌SK-BR-3细胞增殖的影响Fig 6 Breast cancer cells SK-BR-3 were transfected with AdsiBMP9 and the cell proliferation was detected by MTT

形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)有20多种亚型，除了BMP1外，其余都属于转化生长因子(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族成员，它们最先被发现具有诱导骨与软骨形成的作用，最近报道BMPs在多种细胞的增殖、分化、凋亡以及对胚胎发育、器官的形成也起着重要作用［4－7］。BMP9又称为生长分化因子2，最初研究其骨诱导作用，后来发现它还具有成骨以外的生物学活性［8］。有研究表明BMP9通过BMP/SMAD通路上调分化抑制因子ID1表达而促进卵巢癌细胞增殖和抑制前列腺癌PC3细胞的生长、侵袭、转移并通过前列腺癌凋亡受体蛋白4促进前列腺癌细胞的凋亡［9－10］;本实验前期研究发现在乳腺癌高转移系MDA-MB-231细胞中未见BMP9表达，乳腺癌低转移系SK-BR-3细胞高表达BMP9。体外实验证实外源性BMP9能够有效地抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移及侵袭能力并促进细胞的凋亡;裸鼠体内皮下异位移植瘤动物模型也进一步证实了BMP9 能够抑制 MDA-MB-231 肿瘤的生长［11－12］，那么内源性BMP9的高低是否与乳腺癌的恶性程度成正相关，BMP9是通过何种分子机制来抑制MDAMB-231肿瘤的生长，BMP9在肿瘤发生发展中起到何种作用，这一系列问题均有待解决。本研究试图从基因沉默的角度研究BMP9对肿瘤的影响及其相关的分子机制。

RNA干扰 (RNAi)是一种转录后水平的基因沉默机制，小分子双链mRNA(siRNA)能够特异地降解与之互补靶基因的mRNA，沉默目标基因的表达，为基因功能的研究提供了一个重要的方法。本文首先根据针对人 BMP9基因成功构建3组RNAi质粒并成功转染高表达BMP9的乳腺上皮细胞HBL-100，由BMP9的引物做RT-PCR，根据吸光度值筛选出干扰效率最高的RNAi质粒。重组腺病毒载体具有十分广泛的宿主范围，可以感染处于各个阶段的细胞且不整合到宿主细胞基因组，感染效率高，所携带的基因表达水平高，可以很容易制备高滴度腺病毒，为基因功能的研究提供了强有力的工具。故本文将筛选的干扰效率最高的RNAi质粒进一步包装腺病毒，将包装好的腺病毒AdsiBMP9感染乳腺癌SK-BR-3细胞发现AdsiBMP9沉默SK-BR-3细胞内源性BMP9的表达能促进细胞的增殖，在第4和第5天时显著。其具体分子机制有待进一步研究。

本研究筛选并鉴定出了一组针对人BMP9基因的siRNA，并构建了AdsiBMP9重组腺病毒，为研究BMP9在肿瘤发生发展中的作用及具体分子机制提供了重要的分子手段。

［1］Davies SR，Watkins G，Douglas-Jones A，et al．Bone morphogenetic proteins 1 to 7 in human breast cancer，expression pattern and clinical/prognostic relevance［J］．J Exp Ther Oncol，2008，7:327 －338．

［2］冯红蕾，王科，孙笑笑，等．骨形态发生蛋白9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡的作用研究［J］．重庆医科大学学报，2010，35:1619－1623．

［3］王科，冯红蕾，孙笑笑，等．骨形态发生蛋白9抑制人乳腺癌MDA-MB-231体外侵袭和迁移．基础医学与临床，2011，31:360 －365．

［4］David L，Mallet C，Keramidas M，et al．Bone morphogenetic protein-9 is a circulating vascular quiescence factor［J］．Circ Res，2008，102:914 －922．

［5］Ye L，Bokobza SM，Jiang WG．Bone morphogenetic proteins in development and progression of breast cancer and therapeutic potential［J］．Int J Mol Med，2009，24:591 －597．

［6］Scharpfenecker M，van Dinther M，Liu Z，et al．BMP-9 signals via ALK1 and inhibits bFGF-induced endothelial cell proliferation and VEGF-stimulated angiogenesis［J］．J Cell Sci，2007，120:964 －972．

［7］Alarmoo EL，Korhonen T，Kuukasjarvi T，et al．Bone morphogenetic protein 7 expression associates with bone metastasis in breast carcinomas［J］．Ann Oncol，2008，19:308－314．

［8］Herrera B，van Dinther M，Ten Dijke P，et al．Autocrine bone morphogenetic protein-9 signals through activin receptor-like kinase-2/Smad1/Smad4 to promote ovarian cancer cell proliferation ［J］．Cancer Res，2009，24:9254 －9262．

［9］Ye L，Kynaston H，Jiang WG．Bone morphogenetic protein-9 induces apoptosis in prostate cancer cell，the role of prostate apoptosis response-4 ［J］．Mol Cancer Res，2008，6:1594－1606．

［10］毕杨，文巍，何昀，等．骨形成发生蛋白9的siRNA筛选及功能检测［J］．南方医科大学学报，2010，30:659－663．

［11］王科，冯红蕾，孙笑笑，等．骨形态发生蛋白9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响［J］．肿瘤，2011，31:389－393．

［12］Wang K，Feng HL，Ren W，et al．BMP9 inhibits the proliferation and invasiveness of breast cancer cells MDA-MB-231［J］．J Cancer Res Clin Oncol，2011，137:1687 －1696．