Müller细胞反应性胶质化在急性高眼压致大鼠视网膜损伤中作用

苏吉儿，丁静文，韩 松，罗 宏，李俊发*

(1.首都医科大学神经生物学系，北京100069;2.首都医科大学附属北京同仁医院眼科，北京100730)

青光眼是一种常见的致盲性眼病，其病理基础是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)及其神经纤维的丢失。多种因素与其发病有关，其中病理性高眼压可造成视网膜缺血低氧性损伤并导致RGCs凋亡［1］。Müller细胞是视网膜内最主要的神经胶质细胞，不仅起着支持和营养神经元的作用，还包括维持细胞外离子的稳定及参与谷氨酸盐循环、突触传递等作用。近年研究发现，Müller细胞参与多种病理和生理过程，并且在视网膜各种疾病中都伴随Müller细胞的活化，即Müller细胞反应性胶质化［2］。本研究旨在更好地理解 Müller细胞在青光眼视网膜损伤中作用，从而为临床青光眼视网膜神经保护提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级雄性SD大鼠，体质量200～250 g，小鼠单克隆抗大鼠源性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(Cell Signaling公司)，小鼠单克隆抗大鼠源性Thy-1抗体(美国Abcam公司)，原位末端转移酶标记(TUNEL)试剂盒(Promega公司)，Hochest33528染料和胶质毒素AAA(Sigma-aldrich公司)，异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，红霉素眼膏(上海通用药业公司)，5%托吡卡胺眼液(日本参天制药株式会社)，0.5%爱尔凯因眼液(Alcon公司)，卡波姆滴眼液(Bausch＆Lomb公司)。

1.2 实验动物和模型制备

1.2.1 动物分组:将大鼠随机分为1)正常对照组(Ctrl);2)急性高眼压(AOH)1 h后再灌注1、3和5 d组;3)急性高眼压+给药(AOH+AAA)后再灌注1、3和5 d组;4)单纯AAA给药和AOH+PBS对照组。每组n=4。

1.2.2 模型制备和给药:1)AOH模型:前房灌注升高眼压方法建立大鼠高眼压模型，眼内压维持在110 mmHg(14.63 kPa)，持续1 h。于高眼压后各时间点取大鼠眼球进行冰冻切片，厚度为14μm。2)单纯给药组:10%水合氯醛腹腔注射充分麻醉大鼠，角膜表面麻醉，利用微量注射器将AAA注射于大鼠玻璃体内;急性高眼压+给药组:制模后3 h给药，给药方式同前。为了明确AAA的给药浓度和剂量，在参考文献［3］的基础上，选择10、50和100 g/L 3个药物浓度，给药剂量均为5μL。预实验结果显示50 g/L为合适浓度。

1.3 免疫荧光染色

取相应时间点视网膜冰冻切片，10.0 mmol/L含0.3%Triton X-100磷酸盐缓冲液(PBST)洗3次，正常羊血清室温孵育1 h，弃去，按实验设计一抗分别为鼠抗GFAP和鼠抗Thy-1。GFAP高表达是Müller细胞反应性胶质化最主要的特征表现［4］。Thy-1是视网膜神经节细胞特有的细胞表面抗原，能特异性标记神经节细胞。一抗浓度均为1∶200，4℃过夜。弃去一抗，PBST洗3次，滴加二抗FITC或TRITC标记山羊抗小鼠IgG，室温暗盒中孵育1 h，PBST洗3次，Hochest复染10 min，浓度为10 mg/L，PBST洗3次，甘油封片。待切片晾干，荧光显微镜下观察拍照。

1.4 TUNEL染色

TUNEL染色用来标记凋亡细胞。取相应时间点视网膜冰冻切片(Ctrl组、AAA组、AOH 5 d组和AOH+AAA 5 d组)，制备冰冻切片，片厚14μm，4%多聚甲醛固定10 min，按照TUNEL试剂盒的说明书操作。荧光显微镜下观察，呈现绿色荧光的即为凋亡细胞。

1.5 统计学分析

应用SPSS11.5统计软件对实验数据进行统计学处理。各组结果比较时采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。各组实验数据以均值±标准差()表示。

2 结果

2.1 AOH引起视网膜损伤，并诱发Müller细胞反应性胶质化

荧光染料Hochest用于标记视网膜的细胞核。与Ctrl相比，AOH后再灌注1、3和5 d各组术眼视网膜内丛状层(IPL)、内核层(INL)均变薄，随时间延长，损伤逐渐加重(图1)。同时，再灌注3和5 d组神经节细胞层(GCL)和INL细胞排列紊乱，GCL细胞核数目明显减少(图1)。正常大鼠视网膜仅有分布在神经纤维层及GCL的星形胶质细胞有微弱GFAP表达，Müller细胞不表达或很少表达 GFAP(图2)。AOH后再灌注1 d大鼠视网膜Müller细胞开始表达GFAP，此时GFAP在星形胶质细胞的表达也增加。再灌注3和5 d视网膜Müller细胞GFAP表达更加显著，甚至贯穿视网膜全层(图2)。

2.2 AAA抑制AOH诱发的Müller细胞反应性胶质化

与AOH组相应再灌注时间点相比，AOH+AAA组视网膜Müller细胞GFAP的表达均显著减少，但对GFAP在星形胶质细胞的表达没有明显影响(图3)。此外，AOH+PBS组视网膜GFAP的表达与高眼压组相近，排除了溶剂干扰(图3)。

2.3 AAA明显减轻AOH所致视网膜损伤

AOH导致GCL凋亡细胞显著增加，而AOH+AAA组凋亡细胞数明显减少。Ctrl和AAA组未见凋亡细胞。与Ctrl组相比，AOH引起RGCs大量丢失，而AOH+AAA组RGCs的丢失有所减轻。Hochest染色观察不同组视网膜形态，AOH+AAA组缓解了AOH所引起的视网膜厚度变薄、细胞核排列紊乱及GCL细胞数的减少(图4)。

3 讨论

AOH模型是一种较为常用的方法，可用来模拟急性闭角型青光眼的发病状态。实验证实病理性高眼压可造成视网膜的缺血损伤并导致RGCs凋亡。作为视网膜内最主要的神经胶质细胞，Müller细胞参与RGCs的代谢、内环境稳态，在RGCs的生长、损伤、修复和再生中起重要作用。

图1 AOH对大鼠视网膜的影响Fig 1 Effect of AOH on rat retina(n=4)

图4 AAA对AOH所致视网膜损伤的影响Fig 4 Effect of AAA on AOH-induced retinal damage(n=4)

本实验中，AOH组大鼠视网膜随着再灌注时间延长，出现IPL和INL变薄、细胞排列紊乱、GCL细胞数目减少等严重损害，与文献报道的AOH所致视网膜损伤的表现基本一致。本研究还发现AOH模型中，星形胶质细胞、Müller细胞GFAP的表达均有明显增加。GFAP是胶质细胞内特有的中间丝，正常视网膜 Müller细胞不表达或很少表达［5］，在缺血［6］、视网膜脱离［7］等病理情况下，Müller细胞高表达GFAP，被认为是Müller细胞反应性胶质化的标志物。Müller细胞反应性胶质化是指在受到各种急性或慢性病理因素的刺激时被激活而发生不同程度的活化。

目前认为Müller细胞的反应性胶质化是一把“双刃剑”，一方面积极对抗损伤促进神经元的修复，但是另一方面却阻碍组织修复和神经再生［8］。已有文献报道视网膜胶质细胞活化可以降低谷氨酸受体的表达从而导致RGCs的变性死亡［9］。活化的Müller细胞还可通过释放肿瘤坏死因子［10］、NO 等加重 RGCs损伤［11］。本实验通过玻璃体内注射AAA抑制Müller细胞反应性胶质化观察其在青光眼视网膜损伤中的作用。AAA是一种胶质毒素，实验结果显示其能有效抑制Müller细胞反应性胶质化，而对星形胶质细胞的活化不造成影响，与以往的文献报道相一致［12］。结果表明抑制Müller细胞反应性胶质化能有效减少AOH引起的RGCs丢失，显著降低GCL凋亡细胞数目，缓解视网膜各细胞层变薄、细胞排列紊乱及细胞数目减少，对AOH损伤的视网膜具有一定的保护作用。

本研究表明，Müller细胞反应性胶质化参与AOH所致视网膜损伤，抑制其反应性胶质化可明显缓解AOH诱发的RGCs丢失和凋亡发生。提示，调控视网膜Müller细胞微环境，发挥其神经保护作用，如抑制Müller细胞反应性胶质化可能是临床改善高眼压性青光眼视网膜病变的一种有效治疗方法。

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