糖尿病大鼠胰腺血管紧张素受体Mas表达降低

张雪莲，史婷婷，尚 军，王 阳，杨金奎*

(首都医科大学附属北京同仁医院1.内分泌科;2.中心实验室，北京100730)

目前糖尿病影响到全球1.35亿人口，预计到2025年将增长至3亿。肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensin system，RAS)与糖尿病的关系近来引起广泛关注。除了循环RAS外，发现许多组织和器官存在自身的RAS，其中人们对胰腺局部的RAS尤为关注［1］。

RAS可以通过两条不同的通路发挥作用:一条是ACE-AngⅡ-AT1受体轴，另一条是起反向调节作用的ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴。血管紧张素转换酶 2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是RAS的重要负性调节因子，可降解血管紧张素-Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang-Ⅱ)产生血管紧张素(1-7)(angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)，后者是有效的血管舒张肽，并通过与其受体Mas结合在体内拮抗血管紧张素-Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ)的作用［2］。Mas作为Ang-(1-7)的受体为Ang-(1-7)的生物学意义提供生化和分子生物学依据。本研究观察糖尿病发生过程中胰岛细胞Mas的变化，为Mas受体在糖尿病发病中的可能作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

48周龄雄性肥胖自发性糖尿病大鼠(OLETF)与同种系同龄糖耐量正常Long-Evans Tokushima Ostuka(LETO)大鼠各6只，由日本大冢制药公司研究所提供，所有实验均符合实验动物伦理法案。大鼠常规饲料喂养，自由进食、饮水，在12 h明暗交替的同一环境下单笼饲养。OLETF大鼠为O组，同种系同龄糖耐量正常LETO大鼠为L组。

1.2 主要试剂

胶原蛋白酶Ⅴ和戊巴比妥钠(Sigma公司)，含有双抗RPMI-1640培养基和胎牛血清(Gibco公司)，人淋巴细胞分离液(AXIS-SHIELD公司)，Trizol(Invitrogen公司)，RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0(TaKaRa公司)，BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit Manual(北京尚柏公司)，羊抗人Mas多克隆抗体和兔抗人ACE2多克隆抗体(Santa Cruz公司)，大鼠胰岛素ELISA试剂盒(BlueGene)，免疫组化染色试剂盒(Histostain-Plus Rabbit Primary，Invitrogen公司)。

1.3 大鼠一般特征

1.3.1 基本指标测定:观察OLETF大鼠及同种系同周龄LETO大鼠的饮食、活动、饮水等一般情况，定期称量体质量、身长。

1.3.2 口服葡萄糖耐量试验(OGTT)［3］:大鼠禁食14 h，期间自由饮水，次日称体质量。取空腹尾静脉血，灌胃给予葡萄糖(2 g/kg)，于服糖后15、30、60和120 min时取尾静脉血。在空腹及服糖后均另用毛细管于眼眶内眦取血。用强生公司One-Touch血糖仪及葡萄糖氧化酶法测定血糖。ELISA法检测血清胰岛素浓度。血浆生化仪测定血清三酰甘油及总胆固醇。

1.4 Mas及ACE2在大鼠胰岛细胞的表达

1.4.1 胰腺标本处理:大鼠经2%戊巴比妥钠麻醉，取其部分胰腺，标本制成4μm石蜡切片，HE染色，显微镜下观察、拍照。

1.4.2 免疫组化方法(S-P法):按S-P免疫组化试剂盒步骤操作检测大鼠胰腺组织切片中Mas及ACE2蛋白的表达。一抗分别为羊抗人Mas多克隆抗体，1∶50稀释;兔抗人 ACE2 多克隆抗体，1∶50稀释;阴性对照一抗为抗体稀释液。按试剂盒说明染色，加拿大树胶封片。于显微镜下观察，用图像分析仪拍照。阳性判断标准:胞质呈现棕黄色反应颗粒。

1.4.3 胰岛细胞纯化:大鼠经2%戊巴比妥钠麻醉，胆总管内插管逆行注入0.5 mg/mL胶原蛋白酶V溶液，迅速摘取胰腺，移入预置Hanks液的消化瓶中。37℃水浴中静止消化10 min，37℃水浴振荡15 min，加入4℃的Hanks液(含10%胎牛血清)终止消化，获得胰岛细胞悬液。按照文献［4］报道的人淋巴细胞分离液法进行改良，在常温下进行胰岛细胞的纯化，后者用于QRT-PCR、Western印迹法检测。

1.4.4 QRT-PCR检测大鼠胰岛细胞Mas mRNA的表达:应用 Trizol法抽提细胞总 RNA，测定 A260和A280，保证比值在1.8～2.0之间，然后进行反转录。Mas引物序列，上游:5'-GGGTCTAATCGATGATG AGCTTGT-3';下游:5'-CCCGTCACATATGGAAGCA TT-3'。ACE2引物序列，上游:5'-CTCTTGGGAAA AATGCGTATGAA-3';下游:5'-GGCAACAGATGAT CGGAATAGG-3'。RT-PCR检测反应系统依据TaKaRa公司RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0说明步骤进行。用Line-gene荧光定量PCR检测系统，QRTPCR检测反应体系50μL，反应条件:预孵育95℃120 s;扩增95 ℃ 20 s，58 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，45个循环;最后在延伸阶段结束。分析方法:采用2－ddCT法。用 －ddCT代表基因的相对表达量(RQ=2－ddCT)，CT代表扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，dCT=目的基因CT值－内参基因CT值，ddCT=待测样本dCT－标准dCT。

1.4.5 Western blot:提取大鼠胰岛细胞总蛋白，用BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度。取50μg总蛋白进行 10%SDS-PAGE电泳，再电转(100 V，90 min)至硝酸纤维膜上。用TBST(TBS+0.1%Tween-20)配制的5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用封闭液将一抗按照一定比例稀释(羊抗人Mas多克隆抗体1/200稀释，兔抗人 ACE2多克隆抗体1/100稀释)，将膜与一抗4℃摇床孵育过夜，洗膜，再与HRP标记的二抗(1/3 000稀释)室温孵育2 h。同时以β-actin(HRP标记的兔抗人多克隆抗体)作为内参，抗体稀释比例为1/1 000。TBST洗涤，ECL显色，压片，洗片。将显色后的膜或底片照相，并用LabWorks软件对图像进行灰度分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 糖尿病大鼠及LETO大鼠的一般特征比较

2.1.1 体质量和身长及一般情况的观察:O组大鼠体质量较L组显著增加(654±15 g vs 592±12 g，p＜0.05)。每日饮水量及进食量较L组均显著增加(39.5±2.8)g vs(30.6±1.8)g及(19.3±1.6)g vs(11.1±1.3)g(p＜0.01)。

2.1.2 大鼠的口服葡萄糖耐量:O组大鼠的空腹血糖及服糖后15、30、60和120 min血糖水平均显著高于同期L组大鼠(p＜0.01)(图1)。根据OGTT血糖结果及OLETF大鼠糖尿病诊断标准:即服糖后血糖峰值 ＞16.8 mmol/L，且2 h血糖 ＞11.1 mmol/L的大鼠确定为糖尿病(DM)［3］，48周龄OLETF大鼠均达到DM诊断标准。

图1 OLETF大鼠和LETO大鼠OGTT的比较Fig 1 The comparison of oral glucose tolerance in both OLETF rats and LETO rats，n=6)

2.1.3 大鼠的空腹血糖、空腹胰岛素及血脂:O组大鼠的空腹血糖和空腹胰岛素水平均显著高于L组(8.96±0.50)mmol/L vs(6.02±0.86)mmol/L和(1.14±0.04)ng/mL vs(0.95±0.07)ng/mL)(p＜0.05)。O组大鼠血清总胆固醇和三酰甘油水平均显著高于 L组(2.58±0.14)mmol/L vs(2.05±0.16)mmol/L和(3.30±0.66)mmol/L vs(1.57 ±0.22)mmol/L(P ＜0.05)。

2.2 大鼠胰腺的形态学及Mas及ACE2的免疫组织化学分析

大鼠胰腺Mas及ACE2蛋白均定位在胰腺的腺腔和胰岛，棕黄色为阳性着色。大鼠胰腺胰岛及外分泌腺均有Mas及ACE2蛋白阳性表达(图2，3)。

2.3 鼠胰岛细胞Mas及ACE2表达的定量分析

O组大鼠胰岛细胞Mas mRNA水平为0.18±0.06，显著低于 L组的0.59±0.17(p＜0.05)。O组大鼠胰岛细胞ACE2 mRNA水平与L组无显著差异(0.36±0.15 vs0.46±0.19)。

2.4 大鼠胰岛细胞Mas及ACE2的蛋白水平

与L组相比，O组大鼠胰岛细胞Mas的蛋白表达显著下降(p＜0.05)。胰岛细胞ACE2的蛋白表达两组间无显著差异(图4)。

图4 比较OLETF大鼠及LETO大鼠胰岛细胞Mas及ACE2蛋白表达Fig 4 The comparison of islets Mas and ACE2 protein expression in OLETF rats and LETO rats by Western blot，n=6)

3 讨论

近年研究表明，胰腺局部的RAS参与正常人胰腺的生理调控，应用免疫组化方法已证实RAS在人类胰腺内外分泌腺体均有表达［1］。在胰腺内分泌腺，胰岛的RAS在调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌和葡萄糖稳态方面起重要作用。

ACE2最近被认为是ACE的一个新的同源物，ACE2在生理状态及高血压、慢性心力衰竭、糖尿病及糖尿病肾病等病理生理过程中与血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)互相拮抗，其作用主要通过Ang-(1-7)完成。后者是RAS中的重要肽类，具有舒张血管、激活缓激肽、拮抗Ang-Ⅱ等作用［5］。Mas为 Ang-(1-7)受体，在心脏、睾丸、肾脏和脑等中均有表达［6］，具有G蛋白偶联受体的特征。近年来，Mas受体在脑、血管、肾脏、心脏等器官的活性已经被证实［7］。

本研究检测到Mas及ACE2在大鼠胰腺内、外分泌腺均有表达，提示胰腺存在局部的RAS。胰腺局部RAS与胰岛功能之间存在着密切联系，Mas敲除的FVB/N小鼠出现血脂异常、胰岛素水平升高，约有50%出现腹部脂肪块增多［8］。Mas缺失小鼠出现葡萄糖耐量异常和胰岛素敏感性下降，提示Mas受体在胰岛素抵抗发生和发展中的作用。

OLETF大鼠为自发性糖尿病大鼠，利用该品系动物探讨人类2型糖尿病的病因与发病机制具有重要意义。本研究中OLETF大鼠具有肥胖、高血糖、高血脂及高胰岛素水平等特征，这与以往研究结果一致。本研究发现OLETF大鼠胰岛细胞的Mas在mRNA及蛋白水平均显著降低，而ACE2在mRNA及蛋白水平虽然仅呈现下降趋势，提示在糖尿病大鼠胰岛细胞Mas的改变先于ACE2变化。

2型糖尿病发生中RAS作用的确切机制尚不清楚。值得一提的是，最近关于胰岛局部RAS的存在，和其对胰岛功能的作用为应用RAS阻断剂减少2型糖尿病发生的相关临床实验提供了一种新的解释。近年有报道应用Mas受体阻断剂可观察到第一时相胰岛素分泌缺失，Mas缺失小鼠呈现内皮细胞功能受损、NO产生减少［9］。相关报道还证实Ang-(1-7)通过Mas发挥保护心脏的作用，虽然相关的信号通路尚不明确，但慢性Mas缺失将导致心肌细胞 Ca2+流峰值下降［10］。

总之，本实验证实Mas及ACE2在大鼠胰腺的内外分泌腺均有表达，提示胰腺内分泌腺存在内在的RAS。糖尿病大鼠的胰岛细胞Mas基因及蛋白水平的改变为加深了胰腺内分泌腺的RAS与糖尿病关系的理解提供了一定依据。

［1］Cheng Q，Leung PS．An update on the islet renin-angiotensin system［J］．Peptides，2011，32:1087 －1095．

［2］Lopez Verrilli MA，Rodriguez FermepínM，Longo Carbajosa N，et al．Angiotensin-(1-7)through Mas receptor up-regulates neuronal norepinephrine transporter via Akt and Erk1/2-dependent pathways［J］．JNeurochem，2012，120:46－55．

［3］Kawano K，Hirashima T，Mori S，et al．Spontaneous longterm hyperglycemic rat with diabetic complications．Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty(OLETF)strain［J］．Diabetes，1992，41:1422 －1428．

［4］Bugliani M，Lupi R，Del Guerra S，et al．An alternative and simple method to consistently prepare viable isolated human islets for clinical transplantation ［J］．Transplant Proc，2004，36:605－606．

［5］Nakagaki T，Hirooka Y，Ito K，et al．Role of angiotensin-(1-7)in rostral ventrolateral medulla in blood pressure regulation via sympathetic nerve activity in Wistar-Kyoto and spontaneous hypertensive rats ［J］．Clin Exp Hypertens，2011，33:223－230．

［6］Tan Z，Wu J，Ma H．Regulation of angiotensin-converting enzyme 2 and Mas receptor by Ang-(1-7)in heart and kidney of spontaneously hypertensive rats［J］．JRenin Angiotensin Aldosterone Syst，2011，12:413 －419．

［7］Bindom SM，Lazartigues E．The sweeter side of ACE2:physiological evidence for a role in diabetes［J］．Mol Cell Endocrinol，2009，29，302:193 －202．

［8］Santos SH，Fernandes LR，Mario EG，et al．Mas deficiency in FVB/N mice produces marked changes in lipid and glycemic metabolism［J］．Diabetes，2008，57:340－347．

［9］Iwai M，Nakaoka H，Senba I，et al．Possible involvement of angiotensin-converting enzyme2 and Mas activation in inhibitory effects of angiotensin II Type 1 receptor blockade on vascular remodeling［J］．Hypertension，2012，60:137 －144．

［10］McCollum LT，Gallagher PE，Ann Tallant E．Angiotensin-(1-7)attenuates angiotensin II-induced cardiac remodeling associated with upregulation of dual-specificity phosphatase 1 ［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，302:801－810．