等长收缩法测定小鼠阻力血管舒缩反应*

张英展 周应毕 刘斌

随着人们生活水平的不断提高，心血管疾病发病率迅速升高[1]。其中，高血压病已经成为威胁人类健康的主要疾病之一。血管内皮的舒张功能异常会增加外周血管阻力，在高血压的发病过程中血管内皮的舒缩功能异常起到重要作用。普遍认为，血管及其内皮所产生的一系列生化因子维持和调节着血管舒张或收缩反应[2]。等长收缩法离体张力实验能很好地反映血管的伸缩效应[3]。目前，各种小鼠疾病模型和基因敲除小鼠广泛应用于心血管疾病研究，但现阶段离体张力实验普遍用于检测大管径血管，国内对检测小鼠小管径阻力血管少见报道[4-5]。因此，本实验将建立一种用等长收缩法测定小鼠肠系膜动脉血管舒缩效应的方法，为检测小鼠肠系膜动脉张力变化提供直观、可靠的实验方法。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：SPF级C57BL/6成年雄性小鼠（南京大学模式动物研究所，中国）；试剂：花生四烯酸钠盐（AA）、N-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（L-NAME）、苯肾上腺素（PE）、乙酰胆碱（ACh），上述试剂均来自美国sigma公司；重要溶液的配制：生理盐溶液（PSS）：其成分为123 mmol/L氯化钠，4.7 mmol/L氯化钾，15.5 mmol/L碳酸氢钠，1.2 mmol/L磷酸二氢钾，1.2 mmol/L硫酸镁，1.25 mmol/L氯化钙，以及11.5 mmol/L葡萄糖；含60 mmol/L氯化钾的PSS（K+-PSS）：含67.7 mmol/L氯化钠，60 mmol/L氯化钾，其他成分同PSS。仪器：压力传感器（AE801，Kronex公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 血管环的制备 取C57BL/6小鼠肠系膜动脉并置于生理盐溶液（PSS）中，剥离血管周围脂肪和结缔组织，并将动脉横切成1.0 mm长的血管环。

1.2.2 静息血管环张力校正 在体视显微镜下，于装有PSS的37 ℃恒温水浴槽内，将血管环安装在两根直径为50 μm的钨丝间。其中一根钨丝固定，而另一根与微力传感器相连，数据经桥式放大器后连入PowerLab进行采集和处理。血管环的前负荷通过递增法调至最适水平（1.0 mm小鼠肠系膜动脉环约250 mg）。实验时血管环先用60 mmol/L的K+-PSS溶液预收缩，每隔15 min 1次，直至其对K+-PSS的反应达到最佳且可重复。

1.2.3 血管环张力监测 在有或无一氧化氮合酶（NOS）抑制剂（L-NAME）的情况下，加入苯肾上腺素（PE）预收缩，平衡10 min后，使血管张力达到最高值，再加入相应的刺激物，实时记录血管环张力结果。其舒张强度以降低苯肾上腺素诱发收缩的百分比来表示。

1.3 统计学处理 使用PEMS 3.1统计学软件进行分析，计数资料使用字2检验，计量资料以（±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测乙酰胆碱对血管环的舒张效应 按上述试验方法，在30 μmol/L苯肾上腺素预收缩的基础上，分别加入0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 μmol/L的乙酰胆碱，结果如图1所示，可见乙酰胆碱能很好地诱导小鼠肠系膜动脉血管环的血管舒张效应，该效应随浓度的增加而增大，并且在加入乙酰胆碱浓度为0.03～0.3 mol/L时舒张变化幅度最大。

图1 乙酰胆碱对小鼠肠系膜动脉舒张作用成浓度依赖性变化

2.2 检测花生四烯酸对血管环非NO依赖性的舒张效应 分别加入3、10 mol/L花生四烯酸检测小鼠肠系膜动脉血管环的舒张程度。结果如图2所示：加入3 mol/L花生四烯酸诱导小鼠肠系膜动脉血管环产生舒张效应，约为23%；而加入10 mol/L花生四烯酸所诱导的舒张效应约为64%。两种浓度的花生四烯酸对小鼠肠系膜动脉的舒张作用比较差异有统计学意义（P<0.05），并使用SPSS统计软件处理（结果为3次独立实验完成）。

图2 不同浓度花生四烯酸对小鼠肠系膜动脉的舒张作用

3 讨论

一般认为，血管及其内皮释放的各种生化物质在血管的舒缩功能中扮演着重要的角色，参与心血管疾病的发生、发展。因此，建立一种能较好地检测小管径阻力血管功能的实验方法对进一步研究具有重要意义。

目前国内在离体张力实验研究中，血管环多数采用管径较大的血管（如大鼠主动脉或小鼠主动脉等），血管环横切长度多为3.0～4.0 mm。而对更加短小的小鼠阻力血管（如肠系膜动脉等）鲜见报道。在本实验中，笔者采用的直径较小的钨丝（50 μm）和更加灵敏的微力传感器（AE801），可检测到直径为100～200 μm、横切长度为1.0 mm血管环，保证了细小血管内皮的完整、并克服了其长度不够的不足，从而充分满足以肠系膜动脉为代表的小鼠阻力血管舒缩反应检测的需要。在实验过程亦发现，血管剥离程度及速度直接影响实验结果，应快速剥离干净血管，以避免血管内皮活性分子的活性减弱或丧失。

为了清晰地阐明小鼠肠系膜动脉功能性参与，在不抑制NOS的情况下，直接加入血管内皮受体激动剂ACh后，结果引起血管环舒张效应，并且该效应随ACh浓度增加而增大，导致该舒张效应可能是通过血管内皮依赖性NO、内皮超极化因子（EDHF）和内皮环氧化酶（COX）产物PGI2共同作用的结果，但起主要作用可能是内皮依赖性NO的释放，同时该实验也提示血管环的内皮及平滑肌在操作过程中保持着完好的生理活性。虽然NO通过血管内皮发挥舒张血管作用，但是非NO依赖性物质亦在血管中亦发挥着重要作用。为此，通过L-NAME作用排除NO对实验结果的影响的情况下，加入AA后，血管环产生非NO依赖性舒张效应，提示AA可能通过其代谢产物诱导产生舒张效应。

综上所述，通过两种不同类型的刺激物都诱导小鼠肠系膜动脉血管环的舒张效应，表明该实验方法检测以肠系膜动脉为代表的小鼠阻力血管的舒缩反应是完全可行的，从而为以小鼠为模型的心血管疾病研究中检测阻力血管舒缩反应提供直观、可靠的实验方法。

[1]金鑫，姜薇，邓琳瑕.心血管疾病危险因素的研究进展[J].中国医药指南，2012，10（31）：434-435.

[2]王燕锋，彭晓晖，张晨瑶，等.原花色素对大鼠阻力血管舒张作用机制研究[J].中国临床药理学与治疗学，2010，15（2）：170-174.

[3]Zhou Y，Varadharaj S，Zhao X，et al.Acetylcholine causes endothelium-dependent contraction of mouse arteries[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289（3）：1027-1032.

[4]张映桥，余涛，许激扬，等.天麻素对离体大鼠胸主动脉环的舒张作用及其机制[J].中国中药杂志，2012，37（14）：2135-2138.

[5]屈晨，唐亮，祝岩.菲诺贝特对高血压大鼠血管内皮收缩因子分泌的影响及其作用机制[J].中国医学科学院学报，2012，34（3）：239-243.