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益赛普对由异丙肾上腺素引起的小鼠肿大腮腺的影响*

2013-12-04滕艳杰安锦丹陈培杨晓帆王莞赵洪涛

中国医学创新 2013年21期
关键词:唾液腺腮腺试剂盒

滕艳杰 安锦丹 陈培 杨晓帆 王莞 赵洪涛

异丙肾上腺素为β受体激动剂,有强烈的刺激唾液腺肿大的作用[1-4]。多次反复注射引起唾液腺的增生和肥大。肿大的腺体可以作为体内腺体增生和肥大的模型进行研究,因为其增生和肥大的机制还没有完全明了。笔者的前期工作研究表明,异丙肾上腺素引起的腮腺肿大可能与细胞因子TNF-α与IL-1β的增多有关[5],现进一步明确其关系。

益赛普为注射用重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白,能竞争性地与血中TNF-α结合,阻断它和细胞表面TNF-α受体结合,降低其活性[6]。在本研究中,在用异丙肾上腺素引起小鼠唾液腺肿大的同时,给以益赛普TNF-α受体拮抗剂,观察其对腺体肿大的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 (1)实验动物:体重34~42 g的SPF级昆明小鼠,北京维通利华实验动物技术有限公司提供。(2)主要药品与试剂:注射用重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(益赛普)(上海中信国建药业有限公司);小鼠细胞因子TNF-α和IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒(美国Biosource公司);兔抗小鼠多克隆抗体试剂盒(北京百奥博奥森生物技术有限公司);其他生化试剂购于Sigma公司。(3)仪器:Model 550 Microplate Reader (美国Bio-Rad公司)。Nikon1200型显微镜图像采集系统(日本Nikon公司)

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备与实验分组 适应性喂养1周后,21只8周雄性昆明小鼠随机分为三组:对照组、异丙肾上腺素组(IPR组)、益赛普组。后两组每天晚上(18:00)腹腔注射IPR(30 mg/kg),一共注射6次。益赛普组于第1次注射及第4次注射前2 h皮下注射益赛普(15 mg/kg),对照组、IPR组注射同等体积的生理盐水。动物自由饮水、进食,第7天处死,处死前绝食12 h,自由饮水。

1.2.2 标本收集及处理 小鼠断头放血处死。迅速取出腮腺,除去淋巴结、脂肪、结缔组织及包膜,一部分在液氮罐中保存备用。一部分腮腺组织浸入4%多聚甲醛固定后常规石蜡包埋,切片待检。酶联免疫吸附法检测腮腺组织中的肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-1β,严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 腮腺组织病理学观察 各组小鼠腮腺组织石蜡切片分别行苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠腮腺组织一般病理学改变,用Nikon1200显微图像采集系统,200倍视野观察。

1.2.4 免疫组化检测TNF-α和IL-1β的表达 取包埋好切片,按试剂盒说明书步骤进行,兔抗小鼠TNF-α和IL-1β多克隆抗体稀释度为(1:100),DAB显色,苏木素轻度复染核,光镜下观察。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料用(±s)表示,比较采用t检验;所有的统计检验均采用双侧检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织病理学观察结果 小鼠连续注射IPR 6 d后,第7天取出腮腺,与对照组比较,明显肿大;益赛普组腮腺也肿大,但与IPR组相比,差异无统计学意义(数值略)。HE染色结果:对照组腮腺组织结构正常,由分泌部和导管组成,分泌部为浆液腺泡,腺泡细胞及导管包膜完整,形态正常,边界整齐;IPR组小鼠与对照组对比有明显组织学改变,表现为腺泡细胞不同程度的肿胀,间隙变小,腺组织趋于增多,结缔组织成分相对减少,导管未见明显增生。益赛普治疗组与IPR组相比,没有明显的组织学改变(图1)。

图1 各组腮腺组织病理学观察结果(HE染色,×200)

2.2 腮腺组织中TNF-α和IL-1β的表达 对照组腮腺组织TNF-α和IL-1β几乎不表达;IPR组在腺泡细胞有表达,且表达绝大部分近基底部;益赛普治疗组表达部位虽与IPR组相似,但阳性强度较明显减少(图2)。

图2-1 各组腮腺组织中TNF-α的表达(DAB显色,×200)

图2-2 各组腮腺组织中IL-1β的表达(DAB显色,×200)

2.3 ELISA检测结果 各组腮腺中TNF-α和IL-1β指标的比较见表1。

表1 各组腮腺中TNF-α和IL-1β指标的比较(±s)ng/(mg·ml)

表1 各组腮腺中TNF-α和IL-1β指标的比较(±s)ng/(mg·ml)

*与对照组比较,P<0.001;△与IPR组比较,P<0.05

组别 TNF-α IL-1β对照组(n=7) 1.120±0.204 1.904±0.148 IPR组(n=7) 6.861±0.703* 6.586±0.456*治疗组(n=7) 5.843±0.541△ 5.827±0.576△

3 讨论

异丙肾上腺素是非选择性β受体激动剂,慢性注射可引起腮腺的增生和肥大,包括重量增多和DNA、RNA和蛋白质合成都增多。腮腺的肿大也可以通过注射生长因子如表皮生长因子或饮食的改变而出现[7]。除掉处理因素,肿大的腮腺能够恢复正常。腮腺肿大后,唾液分泌增多,所以慢性IPR注射可以用来研究唾液腺的分泌机制及肿大机制。

有报道细胞因子TNF-α信号转导是肝细胞增生的始动因子[8],在口腔干燥综合征患者腮腺腺上皮细胞TNF-α和IL-1β的mRNA表达高出正常水平几十倍,笔者的前期的工作发现由IPR诱导的大鼠肿大腮腺组织TNF-α和IL-1β的蛋白质及mRNA均增多表达,本次实验目的是进一步验证TNF-α和IL-1β和肿大的关系。

本实验在给予IPR注射的同时,给以其可溶性受体拮抗剂,从组织学角度来看,益赛普没有明显改变IPR引起的腮腺的增生和肥大,尽管益赛普组腮腺组织内TNF-α和IL-1β的蛋白表达与IPR组相比,有统计学意义上的减少。免疫组化结果也显示益赛普干预治疗组与IPR组相比较,TNF-α和IL-1β的表达量有所减少。

综上所述,益赛普可溶性TNF-α抗体虽然可以减少IPR所致的小鼠腮腺组织内TNF-α和IL-1β的蛋白表达,但TNF-α和IL-1β的减少并不能减轻IPR引起的腮腺肿大。

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