GST-HDAC4融合蛋白载体的构建及其蛋白表达

邵阳光，刘姣，李丰

（中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，教育部医学细胞生物学重点实验室，沈阳110001）

组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases，HDACs）是真核细胞中的一类重要蛋白酶，参与染色质的结构修饰和基因表达调控，在肿瘤的发生和发展中起重要作用［1］。通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACis） 抑制 HDACs 的作用可使癌细胞凋亡，肿瘤生长状态改变［2］。目前，HDACs已经成为癌症治疗的靶点［3］。人HDACs分为3类：I类与酵母Rpd3同源，包括HDAC1-3、8、11；Ⅱ类与酵母 Hdal同源，包括 HDAC4-7、9、10；Ⅲ类与酵母Sir2同源，包括SIRT1-7。HDAC4可在核质之间穿梭，与多种蛋白相互作用，参与结肠癌、乳腺癌等癌症的发生［4，5］、神经元的存亡［6］，且与神经系统退行性疾病密切相关［7］，然而其确切作用机制尚未明确。本研究利用基因重组技术成功构建人HDAC4的原核表达载体，并对其进行诱导表达、纯化和鉴定，为进一步研究HDAC4的蛋白质相互作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

大肠杆菌DH5α感受态和BL21感受态为本实验室制备；pGEX-5X-1购自 Invitrogen公司。人pcDNA3.1-HDAC4质粒由美国佛罗里达H.Lee莫菲特癌症研究中心E.Seto博士惠赠。

1.2 主要试剂

凝胶回收试剂盒购自Axygen公司，限制性内切酶、DNA分子量标准购自TaKaRa公司，去磷酸化酶及T4 DNA连接酶购自NEB公司，ECL发光试剂盒购自Pharmacia公司，蛋白分子量标准购自MBI公司，异丙基硫代-β-D 半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）购自 Amresco公司，anti-GST 抗体购自Cell Signaling公司，Glutathione Sepharose 4B购自GE Healthcare，其他试剂为国产分析纯。

1.3 pGEX-5X-1-HDAC4原核表达载体的构建

pcDNA3.1-HDAC4经EcoRⅠ单酶切后，凝胶回收纯化获得HDAC4产物。EcoRⅠ单酶切pGEX-5X-1载体，凝胶回收后去磷酸化，再回收。将纯化后的载体和片段用T4 DNA连接酶16℃过夜连接后，转化到E.coliDH5α感受态细胞中，37℃培养过夜。挑取单菌落于LB（Amp）中37℃震荡培养过夜，提取质粒，EcoRⅠ酶切鉴定片段的插入，SalⅠ酶切鉴定插入的方向。选择正确插入的克隆送金斯瑞公司测序。

1.4 GST-HDAC4诱导表达及纯化

pGEX-5X-1和pGEX-5X-1-HDAC4质粒转化E.coliBL21后，于1 mL的LB（Amp）37℃震荡培养过夜，按1︰100稀释菌液，37℃扩培至OD600为0.6时，不同浓度的IPTG28℃诱导培养4 h。4℃离心收集菌体沉淀，裂解后进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色观察。将过夜培养的BL21按1︰1000稀释扩培，IPTG28℃诱导培养4 h。离心收集菌体并裂解后，加入30 μL50%的 Glutathione Sepharose 4B，4℃孵育3 h，用NP-40缓冲液清洗后加入50 μL50%的Glutathione Sepharose 4B，取10 μL 进行 SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色观察。

1.5 Western blot鉴定GST-HDAC4融合蛋白的表达

将上述诱导表达后的蛋白进行8%SDS-PAGE，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，anti-GST抗体（Cell Signaling公司，1︰1000）4℃孵育过夜，TBST洗膜15 min、3次后，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（1︰5000）室温孵育2 h，TBST洗膜15 min、3次，ECL 显影。

2 结果

2.1 pGEX-5X-1-HDAC4原核表达载体的构建和鉴定

将重组质粒pGEX-5X-1-HDAC4经EcoRI单酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，观察到3260 bp的插入片段（图1）。为了鉴定所插入HDAC4全长的方向，将重组质粒经SalⅠ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，结果获得7560 bp和664 bp2条带的为反向，获得5 636 bp和2588 bp2条带的为正向，只有1条4 900 bp带的为载体的自身环化（图2）。正向阳性重组子测序鉴定正确，无移码突变。

2.2 GST-HDAC4的诱导表达及蛋白纯化

pGEX-5X-1及pGEX-5X-1-HDAC4转化BL21后IPTG诱导表达，提取蛋白进行SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色观察诱导条带，与未诱导组相比，重组质粒在146 kDa的位置上出现1条明显的特异性蛋白带（图3）。将已纯化好的融合蛋白进行SDS-PAGE后经考马斯亮蓝染色观察，结果如图4所示，空心五角星表示融合蛋白的条带。

2.3 融合蛋白的Western blot鉴定

用anti-GST抗体对GST-HDAC4融合蛋白的表达进行Western blot鉴定。结果显示：在分子量为120 kDa上方出现1个特异性条带（图5），分子量约为146 kDa，为质粒本身的GST分子量（26 kDa）和HDAC4分子量（120 kDa）之和，说明表达了融合蛋白，与预期结果一致。

3 讨论

核小体是真核生物染色质的基本结构单位，组蛋白是核小体的重要组成部分。组蛋白可以发生多种共价修饰，其中乙酰化是最早被发现且与转录调控有关的组蛋白修饰方式。它是一种可逆的动态过程，由组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferases，HATs）和HDACs共同调控。HATs使染色质结构松散，促进转录；HDACs可使组蛋白去乙酰化，染色质致密卷曲，抑制转录。组蛋白乙酰化水平的异常在各种癌症的发生、发展、增殖和分化中起重要作用，研究HDACs对于进一步了解这些疾病的分子机制也有着重要的提示意义［8，9］。HDAC4是Ⅱ类HDACs成员之一，与Ⅰ类HDACs无论在结构上还是功能上都有很大差异。在结构上，HDAC4除了C端的催化结构域外，还含有1个Ⅱ类特有的N端结构域。功能上，HDAC4能够在核质之间穿梭是区别于Ⅰ类的最大特征。HDAC4是分化和发育过程中重要的转录调节因子，其功能的异常与多种癌症的发生相关，因此深入研究HDAC4的功能及其调控具有重要意义。本研究成功构建了人HDAC4的原核表达质粒，并对其进行诱导表达、纯化和鉴定，为深入研究HDAC4与蛋白质的相互作用及其生物学意义奠定了基础。

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