化疗耐药及敏感卵巢癌细胞差异表达microRNA的筛查与组织鉴定

陶陶，王敏

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004）

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中占第二位［1］，死亡率仍徘佪在70%左右，高居妇科恶性肿瘤首位，晚期患者的5年生存率仅为25%～30%［2］。尽管近年来手术、化学药物治疗和放射治疗技术不断改进，卵巢癌5年生存率仍无明显提高［3］。其中最重要一个原因是30%～40%的卵巢癌患者对化疗耐药；不仅如此，60%对一线化疗敏感的卵巢癌患者在半年以后也产生耐药。因此明确卵巢癌耐药的确切机制以及耐药逆转已成为当前全球妇产科学界极其紧迫而重要的研究课题。microRNA是新近发现的一种发育时序性基因［4］，与妇科恶性肿瘤的发生、发展及预后密切相关。microRNA芯片是用来检测microRNA表达谱的一种生物芯片，适用于大规模的基因检测和基因功能的研究、疾病发生机制的研究及临床诊断等方面。本研究采用microRNA表达谱基因芯片方法检测化疗耐药及敏感卵巢癌细胞差异表达microRNA后，选取部分差异表达的microRNA进行实时聚合酶链反应验证，从基因水平研究卵巢浆液性癌化疗耐药发生的相关机制，为卵巢浆液性癌的积极治疗及改善预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 microRNA表达谱基因芯片与卵巢癌细胞：microRNA表达谱基因芯片为北京博奥生物有限公司提供的Affymetrix基因芯片。microRNA表达谱基因芯片检测的细胞为紫杉醇耐药卵巢癌细胞skov3-tr30及其敏感细胞skov3，均由浙江大学医学院附属妇产科医院提供。

1.1.2 实时聚合酶链反应的临床标本：收集2008年8月至2011年8月中国医科大学附属盛京医院妇产科经手术切除后病理学检查证实为卵巢浆液性癌的新鲜组织标本共106例。所有卵巢浆液性癌患者均具备完整的病理资料，对系统行紫杉醇+卡铂化疗治疗患者的化疗情况跟踪随访6个月，其中化疗耐药组20例，化疗敏感组20例。40例卵巢浆液性癌患者年龄38～79岁，平均年龄55.25岁。绝经后患者33例，绝经前患者7例。按国际妇产科联盟2009年手术病理分期标准：Ⅰ期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期29例，Ⅳ期0例；G1级1例，G2级20例，G3级19 例；分期行淋巴结清扫术26例，其中有盆腔淋巴结转移11例。化疗耐药及敏感标准根据2010年美国国立综合癌症网络卵巢癌临床实践指南，肿瘤在6个月内复发的患者为化疗耐药，初次化疗后6个月或更长时间复发的患者被认为是“敏感”的病例［5］。

1.2 实验方法

1.2.1 microRNA表达谱基因芯片检测：按照总RNA的提取说明书抽提基因芯片总RNA，对基因芯片靶标制备及标记microRNA，进行芯片杂交染色及扫描并检测与分析。

1.2.2 实时聚合酶链反应：为鉴定表达谱基因芯片，对miR-17～92基因簇在卵巢浆液性癌组织中采用实时聚合酶链反应方法进行检测。（1）提取组织的总RNA：用液氮法提取组织中的总RNA置于0.01%DEPC-H2O中，-80℃冰箱保存备用。（2）cDNA合成：按反转录试剂盒（PrimescriptTMRT reagent Kit）产品说明书将总RNA反转录成cDNA，用10 μL反应体系。（3）扩增：用TaqMan microRNA试剂盒提供的特异的实时聚合酶链反应引物对合成的cDNA进行实时聚合酶链反应。每个标本都用β-actin作为内对照，β-actin的水平同样用TaqMan探针法进行测定。其中miR-17～92基因簇引物及探针序列：F5′-CAGTAAAGGTAAGGAGAGCTCAATCTG-3′；R5′-CA TACAACCACTAAGCTAAAGAATAATCTGA-3′；6-FA M-TGGAAATAAGATCATCATGCCCACTTGAGAC-TA MRA。β-actin 引物及探针序列：F5′-GCAAAGACCT GTACGCCAACA-3′；R5′-TGCATCCTGTCGGCAATG-3′；6-FAM-TGGCGGCACCACCATGTACC-TAMRA。经过PCR反应后得到扩增曲线。将底物用DEPC水按照10 倍梯度稀释成1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000，进行实时聚合酶链反应获得标准曲线。

1.3 统计学处理

分析实时聚合酶链反应中基因表达的相对变化采用改良的相对定量法（Fold induction=2ΔCt），采用SPSS17.0统计软件包对所得结果进行两两样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 microRNA表达谱基因芯片结果

根据Affymetrix基因芯片技术分别检测紫杉醇耐药卵巢癌细胞skov3-tr30及其敏感细胞skov3中microRNA表达，检测出原始芯片数据共2张，对检测出原始芯片数据采用聚类分析软件CLUSTER3.0分析，表达谱基因芯片可筛查出不同表达的microRNA，其中黄色代表高表达，蓝色代表低表达（图1）。

2.2 差异表达microRNA的数据分析

利用p-value方法对基因芯片杂交结果进行分析，筛选出171个相关的microRNA，其中miR-17、miR-19b、miR-92-1、miR-210、miR-1307 等 69 个microRNA 高表达 （上调趋势），miR-134、miR-34、miR-196b等102个microRNA低表达（下调趋势）。miR-17～92基因簇是与卵巢癌耐药最相关的microRNA之一。见表1。

2.3 实时聚合酶链反应对miR-17～92在卵巢浆液性癌组织中的验证结果

由已知拷贝数的标准品绘制标准曲线（图2），根据样品的Ct值求出样品的模板量，以确定应用目的基因与内参基因的扩增效率一致。应用实时聚合酶链反应检测miR-17～92基因簇在化疗耐药与敏感卵巢浆液性癌组织中扩增曲线（图3），miR-17～92基因簇在化疗耐药与敏感卵巢浆液性癌组织中平均Ct值分别为28.745～35.845及28.175～31.46，β-actin平均 Ct值分别为17.17～22.41及18.175～21.38。miR-17～92基因簇在化疗耐药卵巢浆液性癌组织中的表达量为2.2143E3±6.97E2，在化疗敏感卵巢浆液性癌组织中的表达量为1.4841E3±6.44E2，化疗耐药组中的表达量水平显著高于化疗敏感组（P<0.01），与芯片结果一致。

2.4 miR-17～92基因簇表达与卵巢浆液性癌临床病理学特征的关系

miR-17～92基因簇表达量与卵巢浆液性癌患者绝经前后、手术病理分期、组织学分级、是否行淋巴结清扫术和有无淋巴结转移均无明显相关性（P值分别为0.648、0.377、0.896、0.692、0.274，均 P>0.05），对20例化疗耐药卵巢浆液性癌miR-17～92基因簇表达进一步分析亦与其临床病理学特征无关（P值分别为0.142、0.574、0.428、0.784、0.874，均 P>0.05），见表2。

3 讨论

microRNA是一种发育时序性基因，microRNA与肿瘤的关系已在多种肿瘤中得到证实。大量的研究表明，microRNA在女性生殖系统疾病，包括卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫平滑肌瘤、卵巢子宫内膜异位症等的表达密切相关［6～8］。表达谱基因芯片技术通过对mRNA的荧光分子进行标记来检测基因表达水平的变化，是集分子生物学、细胞遗传学、生物化学、生物信息学等多种高新技术为一体的研究手段，它是一种对基因序列及功能进行大规模、高通量的研究方法。有关卵巢癌与正常卵巢组织或细胞的表达谱基因芯片研究已有报道，但应用表达谱基因芯片对紫杉醇耐药卵巢癌细胞skov3-tr30及其敏感细胞skov3进行基因表达谱分析尚未见报道。

我们通过对紫杉醇耐药卵巢癌细胞skov3-tr30及其敏感细胞skov3进行基因表达谱芯片分析，筛选出了171个与紫杉醇耐药卵巢癌细胞相关的microRNA，基因表达增高（上调趋势）69个，为miR-17、miR-19b、miR-92-1、miR-210、miR-1307 等，基因表达降低（下调趋势）102个，为miR-134、miR-34、miR-196b等，我们发现miR-17～92是与卵巢癌耐药最相关的microRNA之一，因此认为microRNA表达谱基因芯片可筛查出化疗耐药及敏感卵巢癌细胞的差异表达基因，miR-17～92基因簇与卵巢癌化疗耐药有关。miR-17～92是一个典型的多顺反子miRNA基因簇，在人类基因组中位于染色体13q31.3基因cl3或f25的内含子3上，此区域在多种类型淋巴瘤及实体瘤中被扩增［9］，与细胞增殖有关。miR-17～92基因簇大约占据人类染色体的800对碱基对，包括miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-19a、miR-19b 和miR-92-1。它参与了心、肺、免疫系统的发育、血管生长及前脂肪细胞分化等过程。miR-17～92基因簇诱导肿瘤发生主要是通过抑制抑癌基因和细胞周期调控基因的表达实现的。细胞增殖周期调节失控是恶性肿瘤的一个重要特征，miR-17～92基因簇参与肿瘤的发生也与其干扰细胞周期的调节有关。在离体条件下，转染miR-17～92基因簇到不同的淋巴瘤细胞中能使促凋亡蛋白基因BIM和抑癌基因p21的表达下调［10］。我们前期应用病毒介导法将构建的与卵巢癌耐药最相关的miR-17～92抑制质粒转染入耐药卵巢癌细胞抑制其表达，发现miR-17～92基因簇可以抑制耐药卵巢癌细胞的增殖，使耐药卵巢癌细胞阻滞在G2/M期。

目前有关microRNA在卵巢癌化疗耐药中的作用研究主要集中在表达谱基因芯片的建立上，对于筛查出的microRNA在卵巢癌化疗耐药中的功能角色的研究才刚刚起步。Boren等［11］及Orrentino等［12］已证明microRNA表达的不同与卵巢癌化疗耐药与敏感有关。如miR-214通过影响PTEN以及蛋白激酶B（Akt/PKB）的功能，诱导细胞存活和顺铂耐药［13］。我们随后选取化疗耐药与敏感卵巢浆液性癌组织各20例进行实时聚合酶链反应检测miR-17～92基因簇，比较表达谱基因芯片与实时聚合酶链反应表达结果是否一致。发现miR-17～92基因簇在化疗耐药卵巢浆液性癌组织表达明显上调，化疗敏感组织表达下调，与芯片结果一致。本研究首次表明，miR-17～92基因簇在化疗耐药与敏感卵巢浆液性癌组织有差异表达，与卵巢浆液性癌化疗耐药相关。Lewis等［14］研究认为，miR-17～92通过PTEN和BIM起作用，miR-17～92作用于靶蛋白后如何参与卵巢癌的耐药及其相关耐药通路的调控，值得进一步深入研究。因此，对microRNA进行分析可为卵巢浆液性癌化疗耐药的研究提供理论依据，可作为化疗耐药卵巢癌患者治疗及预后的新靶点，为卵巢癌患者的化学药物治疗提供了新的研究方向，有可能成为新的基因治疗途径，对改善卵巢癌患者的治疗现状具有重要的现实意义。

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