不同扶正方对红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ煎出量的影响

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(苏州市中医医院，苏州市中医药研究所，江苏 苏州 215009)

不同扶正方对红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ煎出量的影响

王斐，张露蓉，许恒，江国荣*，李盠键

(苏州市中医医院，苏州市中医药研究所，江苏 苏州 215009)

目的:建立红豆杉水煎液中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)HPLC分析方法,观察不同扶正方(养阴代表方、益气代表方、温阳代表方)对红豆杉中10-DABⅢ煎出量的影响。方法：采用反相高效液相色谱法,C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为甲醇∶水(40∶60)，流速为1 mL/min，检测波长为：227 nm，柱温为25 ℃。结果:10-DABⅢ在20～400 μg/mL范围内峰面积与含量成线性关系(Y=6.501 5X+20.792，r=0.999 97),平均回收率为103.86%(RSD=1.83%)。红豆杉组、红豆杉配伍养阴代表方组、红豆杉配伍益气代表方组、红豆杉配伍温阳代表方组中10-DABⅢ的含量依次为(2.004±0.091)、(2.286±0.073 4)、(2.096±0.097)、(1.640±0.138)mg(n=3)。结论:不同扶正方对红豆杉中10-DABⅢ煎出量存在明显差异,可为红豆杉临床合理使用提供参考实验依据。

红豆杉;10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ);扶正方;中药配伍;高效液相色谱法

红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物,又称“紫杉”，我国有南方红豆杉、东北红豆杉等5个品种。近年来，人工栽培的红豆杉资源丰富，其化学成分与野生南方红豆杉相近[1]。现代药理学研究[2-6]发现，红豆杉中除紫杉醇外,还有10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)、多糖等多种成分,也具有抗肿瘤作用。本实验以10-DABⅢ主要有效成分为考察对象，建立红豆杉水煎液中10-DABⅢ的HPLC分析方法,观察常规临床剂量的红豆杉与我院肿瘤科3个常用的扶正方(分别为养阴代表方、益气代表方、温阳代表方)配伍后的10-DABⅢ含量差异，以期为红豆杉抗肿瘤临床合理使用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1100LC高效液相色谱仪(G1311A四元泵、G1313A进样器、G1316A柱温箱、G1315B紫外检测器和G2170AA工作站，美国Agilent)；AG285型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo)。

1.2 试药 南方红豆杉饮片购自于马鞍山市上工中药饮片有限公司(批号：100101)；养阴代表方由沙参、麦冬和五味子组成，益气代表方由黄芪、党参、白术、茯苓、炙甘草组成，温阳代表方由附子、干姜、甘草组成，相关中药饮片购自于苏州市春晖堂药业有限公司。10-DABⅢ标准品(中国生物药品检定所，32981-86-5)；甲醇(色谱纯，Scharlab S.L.)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[7]色谱柱：大连依利特Hypersil ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶水(40∶60)；流速为1.0 mL/min，检测波长为227 nm,柱温为25 ℃。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取10-DABⅢ标准品8.0 mg，置20 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为400 μg/mL的10-DABⅢ标准储备液。精密量取上述标准储备液0.5、1.0、2.5、5.0 mL分别至10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，得20、40、100、200 μg/mL的10-DABⅢ标准品溶液。

2.3 供试品溶液的配制 红豆杉组、红豆杉配伍养阴代表方组、红豆杉配伍益气代表方组、红豆杉配伍温阳代表方组供试品的制备:精密称取各组相应的中药适量(其中配伍方中的红豆杉均为6 g)，加3倍量蒸馏水浸泡0.5 h，再加入5倍量水，回流提取1 h,过滤。取药渣，再加入5倍量水，回流提取1 h，合并2次滤液。滤液浓缩适量，得到浓度为1 g(生药量)/mL的浓缩液。4 ℃密封保存备用。

2.4 阴性对照溶液的配制 精密称取的养阴代表方、益气代表方、温阳代表方，按照2.3项下的提取方法制备。

2.5 系统适应性实验 见图1。

A.10-DABⅢ标准品；B.红豆杉水煎液；1.10-DAB Ⅲ图1 红豆杉中的10-DABⅢ色谱图

图1显示，在此检测条件下，10-DABⅢ出峰时间为20.355 min左右，色谱分离度良好，峰形较好，分离无干扰。

2.6 线性关系考察 分别吸取20、40、100、200、400 μg/mL 的标准品溶液各5 μL注入液相色谱仪中，记录峰面积。以10-DABⅢ的峰面积(Y)为纵坐标，以10-DABⅢ的含量(X)为横坐标，建立回归方程Y=6.502X+20.792，相关系数r=0.999 97。结果表明10-DABⅢ在20～400 μg/mL范围内，峰面积与含量呈线性关系。

2.7 精密度试验 精密吸取浓度为100 μg/mL的10-DABⅢ对照品溶液5 μL,连续进样5次，记录峰面积，得RSD为0.54%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.8 重现性试验 取红豆杉6分，每分6 g，精密称定。按照2.3项下制备。进样5.0 μL，记录峰面积，结果红豆杉中10-DABⅢ的平均含量为0.333 9 mg/g,RSD=4.48%(n=6)，表明本法重复性良好。

2.9 稳定性试验 取红豆杉6 g，精密称定。按照2.3项下制备。分别于0、1、2、4、16、24 h进样5.0 μL，记录峰面积，RSD为1.96%。说明供试品溶液中10-DABⅢ的含量在24 h内的稳定性。

2.10 回收率试验 取已知含量的红豆杉6分，每分3 g，精密称定，加入1 mg 10-DABⅢ标准品，照2.3项制备，进样5 μL。记录峰面积。计算所得平均加样回收率为103.86%，RSD为1.83%。说明用该方法测定10-DABⅢ的含量有较好的回收率。

2.11 不同扶正方对红豆杉中10-DABⅢ煎出量的影响 红豆杉配伍养阴代表方组、红豆杉配伍益气代表方组、红豆杉配伍温阳代表方组按2.3项下制备(n=3),养阴代表方、益气代表方、温阳代表方按2.4项下制备，再按2.1项色谱条件进样，进样量5 μL，结果见表1。

组 别含量/mg增量/mg增量百分比/%红豆杉组 2.004±0.0907--红豆杉配伍养阴代表方组2.286±0.07350.28214.07红豆杉配伍益气代表方组2.096±0.09660.0924.59红豆杉配伍温阳代表方组1.640±0.1384-0.364-18.17

结果显示：红豆杉配伍养阴代表方组，红豆杉配伍益气代表方组峰分离完全，无干扰。红豆杉配伍养阴代表方组中10-DABⅢ的含量明显增加，红豆杉配伍益气代表方组中10-DABⅢ的含量略有增加，红豆杉配伍温阳代表方组中10-DABⅢ的含量明显降低。提示:不同的配伍方药对红豆杉中10-DABⅢ煎出量的影响不同。

3 讨论

中药复方配伍讲究“君臣佐使，协同作用”的配伍原则，同一中药在不同方药配伍下的剂量、作用等均有所不同。我院红豆杉的抗肿瘤临床用量为3～9 g，主要是与养阴法、益气法、温阳法的代表方配伍使用，初步观察结果表明与养阴代表方或益气代表方配伍使用的疗效要优于与温阳代表方配伍使用。本文选择了以红豆杉6 g的临床常用剂量进行与3个扶正方配伍后的10-DABⅢ初步分析，配伍红豆杉后，10-DABⅢ的含量依次为养阴代表方组gt;益气代表方组gt;温阳代表方组，这与临床初步疗效观察基本一致。提示不同的配伍方药对红豆杉中10-DABⅢ煎出量有明显的影响，可能是临床抗肿瘤效应差异的主要原因之一。

目前红豆杉临床使用以水煎剂为主的形式达到临床治疗作用。紫杉醇是从红豆杉中最早发现的具有明确抗肿瘤作用的成分，但其几乎不溶水。而10-DABⅢ具有较好的水溶性,在南方红豆杉的不同部位(叶、枝等)均含有，是红豆杉中含量较高的紫杉烷类化合物之一[7]，近期研究[5,8]表明，10-DABⅢ也具有抗肿瘤等多种活性作用。提示10-DABⅢ是红豆杉饮片水煎液的主要抗肿瘤成分之一。

目前，红豆杉中10-DABⅢ测定中样本处理常规是醇提取[7],而10-DABⅢ的水溶性较好，前期预实验对水提取与醇提取方法进行了比较，也显示2种条件下红豆杉中10-DABⅢ含量相近， 且红豆杉水煎液中10-DABⅢ分离效果与文献[7]一致。故本文在此基础上建立红豆杉水煎液中10-DABⅢ的HPLC分析方法。

本课题选用的3个代表方均为我院肿瘤科临床使用的扶正方药,与红豆杉抑制肿瘤效应成分进行优势配伍，充分体现了中医扶正祛邪的癌症治疗理念。进一步对红豆杉的抗肿瘤效应成分，以及与扶正方药合用时的成分变化、抗肿瘤效应和作用机理的研究，将更有利于红豆杉饮片的临床合理利用。

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1007-4813(2013)03-0391-03

苏州市2010年度科技发展计划(社会发展)项目(编号:SYSD2010166)。

王 斐(1979-)，女，硕士，工程师。研究方向：中药分析与临床药学。

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江国荣,教授,硕士研究生导师,E-mail:guorongjiang@hotmail.com。

2013-01-04)