福建黄兔卵泡抑制素βA亚基cDNA的克隆与序列分析

桑 雷，孙世坤，陈冬金，陈岩峰，谢喜平

(福建省农业科学院 畜牧兽医研究所，福建 福州 350013)

抑制素( Inhibin, INH) 是睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞分泌的一类糖蛋白激素, 由α和β两个亚基通过二硫键连接而成的二聚体[1]，其α亚基上有糖基化位点，β亚基有A、B 两种类型, 故INH存在2种形式，即INHA(αβA)和INHB(αβB)[2]。二硫键是INH行使抑制垂体FSH分泌功能所必须的主键，分离的α和β亚基均无生物学活性[3]。INH对动物生殖机能具有重要调节作用，INH对雌性动物最基本的生物学作用是抑制FSH的合成和分泌, 调节卵泡发育和成熟。INH对雌性动物卵泡发育的作用随着卵泡的逐渐成熟而增强, 这种作用具有剂量依赖关系[4]。通过抑制素抗原免疫可以促进动物卵泡发育，有效地提高雌性动物的排卵率，提高家畜的繁殖力。在雄性动物中，INH主要与公畜的精液品质和雄性不育显著相关，抑制素免疫能有效提高雄性动物的繁殖性能[5]。在生产上，INH是确定单胎和多胎动物种属特异性排卵数最重要的激素之一[6-7]。因此，INH的α和β亚基可作为研究家畜繁殖性状的候选基因。

福建黄兔是我国地方优良肉兔品种，具有适应性广、抗病力强、胴体品质好、繁殖率高等诸多优点[8]。本试验以福建黄兔为对象，克隆了卵泡抑制素βA亚基基因(INHBA)，并对其进行生物信息学分析，为下一步研究福建黄兔的高繁特性提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材 料

总RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒购自Omega公司；pMD18-T载体、AMV反转录酶、DNA Maker和dNTPs(2.5mmoloL-1)均购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR Master Mix(2×)购自fermentas；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA制备 从福建省连江玉华山生态农场购买福建黄兔母兔，在发情中期屠宰黄兔，取出垂体，在液氮中充分研磨后，按照Total RNA I(OMEGA)说明书提取垂体组织总RNA。按照AMV反转录酶使用说明书进行反转录合成cDNA，-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR引物的设计 根据GeneBank中家兔INHBAcDNA的预测序列(XM_002713770.1)设计引物，预计扩增的产物片段大小约为1 200 bp左右，上游引物5'-ATGCCCTTGCTCTGG-3'，下游引物5'-CTATGAGCAGCCACAC-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 RT-PCR扩增 用所设计的引物进行PCR扩增，扩增体系为20 μL，其中2×Mix 10 μL、上下游引物(100 μmolomL-1)各0.2 μL、cDNA 0.2 μL、补充去离子水至20 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min后进入循环，循环参数94 ℃变性 30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环后，72 ℃延伸10 min。反应结束后，用1.0%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳并观察。

1.2.4 PCR产物的克隆与鉴定 PCR产物经胶回收试剂盒回收纯化后与pMD18-T载体在16 ℃下连接过夜。连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂布含50 μg/mL氨苄青霉素LB平板，过夜培养，筛选阳性克隆。随机挑取5个阳性克隆，用PCR法和双酶切法鉴定重组质粒。

1.2.5 序列测定及分析 将鉴定为阳性的克隆由宝生物工程(大连)有限公司进行DNA测序。利用DNAStar等软件，将所得到的cDNA序列与Genbank数据库中已知的哺乳动物INHBA基因相应序列进行序列分析。

2 结 果

2.1 总RNA的分离

所分离总RNA A260/A280为1.9，琼脂糖凝胶电泳后清晰可见18S和28S 2条核糖体RNA条带(见图1)，图1说明脑垂体组织总RNA提取过程中未发生降解。

2.2 RT-PCR扩增、PCR产物克隆及其鉴定

RT-PCR扩增后，产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到明显特异性条带，PCR产物大小与预期结果一致，大约为1 200 bp(见图2)。PCR产物纯化后与pMD18-T载体连接，连接产物转化至DH5α细胞中，经氨苄青霉素平板筛选，随机挑取5个阳性克隆，通过PCR和双酶切进行鉴定，证实扩增克隆的片段大小均正确。

图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳Fig. 1 Agarose electrophoresis of total RNA

图2 福建黄兔INHBA PCR扩增产物Fig. 2 PCR product of INHBA of Fujian Yellow Rabbit

M. D2 000 DNA Maker; I.INHBA基因扩增条带

M. D2 000 DNA Maker; I. amplification product ofINHBAgene

2.3 序列分析

2.3.1 黄兔INHBA基因信息 黄兔INHBAcDNA经测序得到由1 275 bp组成的开放阅读框(ORF)，其实密码子为ATG，终止密码子为TAG。将所得序列登陆到GenBank(登录号：KC831577)。采用DNASTAR软件分析INHBA基因cDNA序列中的A、T、G、C的含量，比例分别为23.76%、31.92%、16.24%、28.08%，G+C含量(60%)高于A+T的含量(40%)；该段序列共编码424个氨基酸，通过SignalP 4.1 软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)预测发现黄兔INHBA蛋白在第20和21氨基酸之间存在信号肽的切割位点(D=0.793，D-cutoff=0.450)，整个蛋白包括20个氨基酸的信号肽和404个氨基酸的成熟肽(见图3)。利用NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在线工具Conserved Domain Search Service软件分析发现INHBA蛋白在第30至250氨基酸处存在1个TGF-β前肽结构域及在第318至423氨基酸处存在1个TGF-β结构域(见图4)。

2.3.2 同源性序列分析 应用Lasergene v7.1 DNAStar软件对所测得结果进行分析，结果显示，所扩增的黄兔INHBA基因长度约为1 275 bp与灵长目中的人、大猩猩同源性分别为91.0%和91.3%，与偶蹄目中的奶牛、山羊、绵羊、猪同源性分别为89.2%、89.6%、89.7%和88.3%，与奇蹄目中的马的同源性为88.8%，与啮齿目中的家鼠、挪威鼠、黄金地鼠同源性分别为88.1%、87.8%、87%，与家猫的同源性为89.5%见表1。根据INHBA基因的同源性构建的系统进化树发现，黄兔与灵长目动物同源性很高见图5。

图3 INHBA蛋白的信号肽预测Fig. 3 Signal P prediction of INHNA protein

图4 INHBA蛋白的结构域Fig. 4 Structural domain of INHBA protein

表1INHBA基因在哺乳动物之间核酸同源性比较
Table 1 Homology analysis ofINHBAon nucleotides in kinds of mammalians

3 讨 论

通过对INHBA基因的cDNA序列进行生物信息学分析发现，该序列含有完整的开放式阅读框，含有1275个核苷酸，编码424个氨基酸的INHBA前体蛋白，其中前20个氨基酸经预测为信号肽，21至424为成熟的INHBA蛋白。通过对福建黄兔和不同哺乳动物的INHBA基因序列进行比对发现，黄兔的INHBA基因与灵长目中的人、大猩猩亲缘性最高，达到90%以上，与偶蹄目中的奶牛、山羊、绵羊、猪同源性介于85%～90%之间，与奇蹄目中的马的同源性为88.8%，与啮齿目中的家鼠、挪威鼠、黄金地鼠同源性在85%以上，在不同的哺乳动物物种间高度保守。对INHBA蛋白进行结构域分析，该蛋白含有1个TGFβ家族结构域和1个TGFβ前体超家族结构域，具有自分泌和旁分泌生长因子的活性，可以通过与TGFβ家族受体或TGFβ超家族受体结合，参与垂体、性腺和胎盘等多种细胞器的生长和发育[9-11]，此间接佐证了抑制素通过两个结合蛋白：β多聚糖(TGFβ家族III受体)和抑制素结合蛋白(INHBP120)发挥生物学作用的共受体假说[3]。动物的生殖主要受下丘脑-垂体-性腺轴分泌的生殖激素调控，其中促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)作用于性腺，通过调节雄性动物的精子发生、成熟过程和雌性动物的排卵过程参与生殖调控[12]。INH对FSH起负反馈调节作用，调控FSH的合成与分泌，进而影响到生殖细胞的发育和成熟[13]。INHBA基因多态性主要与公畜繁殖性状(主要为精液品质)相关[14-17]；在母畜上，小尾寒羊INHBA基因第2外显子上检测到的1个SNP(A218G)与产羔数显著相关(P<0.05)[18]。

图5 INHBA基因核酸序列的遗传进化Fig. 5 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of INHBA gene

4 结 论

因此，INHBA基因可以作为筛选影响福建黄兔繁殖性状的候选基因，对INHBA克隆和序列分析，可以为后续的多态位点检测提供参考。

参考文献：

[1] Medan M S，Arai K Y，Watanabe G，et al．2007 Inhibin: Regulation of reproductive function and practical use in females[J]．Animal Science Journal，2007，78(1)：16-27．

[2] Meldi K M，Gaconnet G A，Mayo K E．DNA Methylation and histone modifications are associated with repression of the inhibin α promoter in the rat corpus luteum[J]．Endocrinology，2013,153(10)：4 905．

[3] 张 超，罗艳梅，张家桦，等．激活素、抑制素及其受体与动物生殖作用的研究进展[J]．中国畜牧兽医，2011，38(2)：115-119．

[4] Chand A L，Harrison C A，Shelling A N．Inhibin and premature ovarian failure[J]．Hum．Reprod．Update，2010，16(1)：39-50．

[5] Sonee M，Bogdan N，Hall L，et al．The inhibin B response to the testicular toxicant 1, 3 dinitrobenzene in male rats[J]．Birth defects research，2013，98(1)：29-34．

[6] 马勇江，马 毅．抑制素及其对动物繁殖的影响[J]．甘肃畜牧兽医，2000(5)：38-40．

[7] 李晓丽，郭志云，曾宪垠．抑制素的研究进展及其在动物繁殖中的应用[J]．四川畜牧兽医，2003(11)：30-32．

[8] 谢喜平，陈岩锋，孙世坤，等．福建黄兔专门化父系选育[J]．福建农业学报，2009，24(5)：433-437．

[9] Ying S Y. Inhibins activins and follistatins: gonadal protein modulating the secretion of FSH[J]．Endocrine Reviews，1988，9：267-293．

[10] Vale W，Rivier J．Purification and characterization of a FSH releasing protein from porcine ovarian follicular fluid[J]．Nature，1986，321：776-779．

[11] Findlay J K．An update on the roles of inhibin, activins and follistratin aslocal regular of folliculogenesis[J]．Bio Reprod．1993，48：15-23．

[12] Sairam M R，Krishnamurthy H．The role of follicle stimulating hormone in spermatogenesis： lessons from knockout animal models[J]．Arch Med Res，2001，32(6)：601-608．

[13] 田 锦，李志民，傅 衍，等．抑制素、活化素和卵泡素研究进展[J]．动物医学进展，2008，29(12)：77-81．

[14] Lin C L，Ponsuksili S，Tholen E，et al．Candidate gene makers for sperm quality and fertility of boar[J]．Animal Reproduction Science，2005，92(3)：349-363．

[15] Giesecke K，Hamann H，Sieme H，et al．IHNBA-associated markers as candidates for stallion fertility[J]．Reproduction in Domestic Animals，2010，45(2)：342-247．

[16] Sang L， Du Q Z， Yang W C，et al．Polymorphisms in follicle stimulation hormone receptor，inhibin alpha，inhibin bata A，and prolactin genes，and their association with sperm quality in Chinese Holstein bulls[J]．Animal Reproduction Science，2011，126(3)：151-156．

[17] Shelling A N，Burton K A，Chand A L，et al．Inhibin：a candidate gene for premature ovarian failure[J]．Hum Reprod，2000，15(12)：2 644-2 649．

[18] Chu M X，Xiao C T，Fu Y，et al．PCR-SSCP Polymorphism of Inhibin βA Gene in Some Sheep Breeds[J]．Asian-Aust J．Anim Sci，2007，20(7)：1 023-1 029．