固体联合发酵对棉粕发酵产物富肽蛋白产量及脱毒效果的影响

程秀芳，朱丽梅，李 丹，谷 巍

(山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000)

随着饲料工业不断发展，动物性蛋白原料日渐短缺，因而开发新的植物源蛋白显得尤为重要。豆粕是应用最为广泛的植物饲料蛋白质资源,蛋白质含量高,但豆粕的使用仅限于成年动物，因为幼畜很难消化大豆蛋白。棉粕是棉籽经脱壳、加热、压扁成薄片用溶剂己烷浸出油后所剩余的副产品，蛋白质含量丰富，是优良的植物源蛋白，由于棉粕中含有对动物有害的游离棉酚，会对动物的生长发育和繁殖造成不良影响[1]，也含有难以消化的纤维素、半纤维素、植酸等抗营养因子[2]，限制了在动物饲料中的应用。因此，降解棉粕中的游离棉酚并通过降解蛋白质提高氨基酸及小肽含量，最终提高棉粕利用率是当前研究的热点之一。孙建义等[3]利用单一菌株假丝酵母菌发酵可对棉粕进行脱毒处理；程福亮等[4]用需氧和厌氧联合发酵提高动物性蛋白原料利用率进行了初步研究，但用两株菌进行有氧和无氧联合发酵的研究报道仍然极少。本研究采用固态联合发酵的方法，将枯草芽孢菌纳豆菌(BacillussubtilisNDX6)接入豆粕、棉粕中，按不同比例混合后进行有氧发酵，再接入植物乳杆菌(LactobacillusplantarumBLLP)进行无氧发酵，试图提高氨基酸及小肽的含量，降低棉粕中游离棉酚的含量，为棉粕脱毒处理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株分别为枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisNDX6)和植物乳酸杆菌(LactobacillusplantarumBLLP)，由山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院保存，其中枯草芽胞杆菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，植物乳酸杆菌发酵用乳酸菌培养基(MRS)。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液制备 (1)枯草芽孢杆菌NDX6菌种子液制备。取经过两次活化的斜面菌种一环约0.05 g于装有100 mL牛肉膏蛋白胨培养基的500 mL三角瓶中，于37 ℃ 180 r/min摇床培养24 h，待用。取经过两次活化斜面菌种一环于盛有100 mL乳酸菌培养基的盐水瓶中，于37 ℃静止培养24 h，待用。(2)植物乳酸杆菌BLLP的种子液制备。取经过两次活化斜面菌种一环于盛有100 mL乳酸菌培养基的盐水瓶中，于37 ℃静止培养24 h。

1.2.2 固态联合发酵方法 有氧发酵配料：称取一定量的原料，豆粕和棉粕按不同的比例混合，分别测定各个配方中的粗蛋白、游离氨基酸和水分，将粗蛋白、游离氨基酸以绝干计。

将各个配方的原料混合均匀装于罐头瓶中，装量50 g/瓶，3个平行样品，料水比为1∶0.8，121 ℃灭菌20 min后取出，使其自然冷却，当温度降至40 ℃左右时接入BNDX6菌，37 ℃发酵36 h后，有氧发酵结束。取样，将样品分成两部分一部分用于计数，一部分样品50 ℃低温烘干，测定游离氨基酸和水分，游离氨基酸以绝干计。

无氧发酵：有氧发酵结束，取样以备检测，然后接种植物乳杆菌BLLP，转入无氧发酵60 h后结束，取样分成两份，一份用于测定乳酸菌活菌数、pH值，另一份50 ℃低温烘干后，测定游离氨基酸、游离棉酚去除率、粗蛋白，联合发酵结束。

1.2.3 配方最佳比例筛选 在豆粕与棉粕的混合原料中，设计六个配方为A-F，每个配方3个平行，豆粕的含量分别为0%、20%、40%、60%、80%、100%,相对应的棉粕的含量分别为100%、80%、60%、40%、20%、0%，分别在有氧发酵和无氧发酵后取样，检测游离氨基酸和游离棉酚，取其平均值。

1.2.4 固态联合发酵的生长曲线 以有氧发酵12 h后开始取样，分别在18 h、22 h、26 h、30 h、34 h、38 h、42 h、46 h、50 h取样，50 ℃低温烘干，测定游离氨基酸、游离棉酚。

以厌氧发酵开始起点为0 h，在0 h、24 h 、36 h、48 h、54 h、60 h、66 h、78 h取样，50 ℃低温烘干，测定游离氨基酸和游离棉酚，根据两指标确定最佳发酵时间。

1.2.5 测定方法 游离氨基酸的测定(以氮计)采用电位滴定法；

活菌数测定采用平板计数法；

游离棉酚测定采用苯胺法(据国标GB13086-91)

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 棉粕与豆粕最佳比例混合发酵的筛选

豆粕和棉粕按不同比例混合进行有氧发酵和无氧发酵后，测定游离棉酚、水溶蛋白(游离氨基酸)、活菌数、pH、粗蛋白，试验结果分别见表1、表2、表3、图1、图2。

表1 联合发酵过程中游离棉酚变化Table 1 Change of free gossypol in the process of fermentation mg/g

注：同行肩标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note:Values with the same lowercase superscripts in the same column were insignificantly different(P>0.05),those with different lowercase superscripts in the same column were significant difference(P<0.05)﹒The same below.

由表1可知，配方A有氧发酵前后差异显著(P<0.05)，游离棉酚降低了约35%，无氧发酵前后比较差异显著(P<0.05)，游离棉酚降低约71%；通过联合发酵后游离棉酚由6.20 mg/g降到1.18 mg/g约81%；配方B在有氧发酵前后比较差异显著(P<0.05)比发酵前降低了约32%，但在无氧发酵后显著的升高(P<0.05)约15.7%，整个联合发酵过程降低了约21%；而配方C、D、E都有不同程度的升高。因此在游离棉酚的去除方面来看，以配方A为最佳。

由表2可知，各配方有氧发酵和无氧发酵中游离氨基酸含量都有显著差异(P<0.05)，配方A在联合发酵后游离氨基酸约升高6.5倍，配方B约升高8.4倍，配方C、D、E、F分别升高9倍、8.8倍，8.0倍和5.4倍。因此，联合发酵能够提高游离氨基酸的含量。

联合发酵中需氧和厌氧发酵后活菌数见图1。由图1可知，有氧发酵后六个配方的活菌数并不高，但是经过无氧发酵后，配方A、B、C、D、E微生物活菌数有所升高，配方A升高了约17倍，特别是配方C活菌数升高了约24倍，因此，无氧发酵对提高活菌数有很重要的意义。

表2 合发酵过程中游离氨基酸含量变化Table 2 Change of free gossypol in the process of fermentation mg/g

图1 各配方在有氧发酵与无氧发酵前、后活菌数变化Fig．1 The formula of living bacteria number changes before and afrer aerobic fermentation and anaerobic fermentation

联合发酵前后pH变化见表3。由表3可知,联合发酵后可以降低饲料的pH。

联合发酵前后粗蛋白的变化见图2。由图2知，联合发酵后粗蛋白的含量比联合发酵前的粗蛋白含量都有所提高，其中以配方A和配方F提高的较多分别约为8%、5%。

在有氧发酵和无氧发酵中，6个配方都能够显著地提高游离氨基酸的含量，无氧发酵中能够显著地提高发酵物中的活菌数，降低发酵物的pH；6个配方的发酵过程中，配方A纯棉粕发酵后的游离棉酚，在有氧发酵及无氧发酵都能够降解游离棉酚的含量，由原来的6.2 mg/g降解到1.18 mg/g，比原来降低了约81%，因此配方A为最佳配方。

表3 发酵前后pH变化 Table 3 Change of pH before and after fermentation

图2 联合发酵前后蛋白质含量变化Fig．2 Changes of protein content before and after combined fermentation

2.2 联合发酵中有氧发酵生长曲线绘制

2.2.1 有氧发酵不同时间点游离棉酚和游离氨基酸变化曲线 由图3可知，有氧发酵中发酵时间在30 h后游离氨棉酚明显降低，游离氨基酸明显升高，在38 h时游离棉酚降至最低，以后趋于平稳；游离氨基酸在18 h～22 h明显升高，22 h后逐渐升高，38 h升至最高，以后趋于平稳，升高不明显。综合两项指标确定发酵时间为38 h为有氧发酵的最佳时间。

2.2.2 无氧发酵中游离棉酚和游离氨基酸随发酵时间的变化曲线 由图4知，在无氧发酵中，游离棉酚含量在36 h后明显降低，60 h后趋于平稳，66 h降至最低，后又趋于平稳；游离氨基酸在24 h后明显升高，36 h后趋于平缓升高，60 h升至最高，在78 h后下降明显；因此，在无氧发酵中发酵最佳时间为60～66 h。游离氨基酸比发酵前游离氨基酸含量提高6.26倍,游离棉酚降低约80%。

图3 有氧发酵中游离棉酚和游离氨基酸随发酵时间的变化 Fig.3 Changes of the contents of free gossypol and free amino acid in anaerobic fermentation accompanying different fermentation time

图4 无氧发酵中游离氨基酸和游离棉酚随发酵时间的变化Fig. 4 Changes of the anaerobic fermentation of free amino acid and free gossypol content in different fermentation time

3 结 论

随着近几年来研究的不断深入，棉酚脱除技术越来越多，包括物理法、化学法、溶剂浸出法、生物脱毒法等。物理法中的高温法和挤压法在降低毒性物质游离棉酚的同时，也降低棉籽饼残油率，从棉籽饼综合利用角度考虑，此方法受到了限制；添加硫酸亚铁、尿素、碱、石灰水等也可脱毒即为化学法，其中最常用的是碱法和硫酸亚铁法。缺点：只能去除游离棉酚，棉酚总量不会发生变化。溶剂浸出法对饲料加工企业来说费用高不可取。

利用微生物发酵—枯草芽孢杆菌NDX6不但能够降低游离棉酚的含量，并且能够大大降解蛋白、提高游离氨基酸及小肽的含量，提高菌体蛋白的含量，从而提高饲料消化吸收的生物利用度，而且经济、环保。

纯棉籽粕利用乳酸菌无氧条件下发酵也能够降解部分游离棉酚，而且无氧发酵还能够降低饲料的pH；提高发酵饲料中的乳酸菌的活菌数，增加有益菌；从而能够酸化动物肠道pH，增加优势菌群，通过竞争抑制有害菌的生长，有效的预防动物肠道疾病的发生，增强动物的免疫力。pH的降低是由于在乳酸菌发酵过程中产生了乳酸、乙酸等小分子的有机酸，对酸化动物的肠道，抑制病原菌的繁殖起到很重要的意义。

总之，将棉粕利用固体联合发酵可以降低毒素-游离棉酚的含量，降解蛋白、提高饲料吸收利用率，增加肠道优势菌从而对动物的肠道疾病起到很好的保健作用。

如何将固体联合发酵工业化大规模生产，提高棉粕的利用率，需要怎样的生产设备达到规模化生产，还需要进一步的试验研究。

参考文献:

[1] Randedel R D,Chase C C,Wyse S J.Effects of gossypol and Cottonseed Products on reproducts on reproduction of manmals[J].J Anim Sci,1992,70:1 628-1 638.

[2] 张继东，王志祥，丁景华，等．棉籽饼粕中天然抗营养因子的危害极力及消除措施[J].畜牧与饲料科学，2006(3):53-55.

[3] 孙建义，许梓荣．利用假丝酵母进行棉籽粕脱毒的研究[J]．中国粮油学报，1995，10(1)：61-64.

[4] 程福亮，胡顺珍，徐海燕．需氧和厌氧联合发酵提高动物性蛋白原料利用率的初步研究[J]．饲料工业，2008,29 (24):32-35.

[5] 贾晓锋，李爱科，姚军虎．固体发酵对棉籽粕棉酚脱毒及蛋白降解的影响[J]．2009,37(3):49-54.

[6] 张文举，赵顺红，许梓荣．复合固态发酵对棉籽饼脱毒效果的影响研究[J]．粮食与饲料工业，2006(6)：35-37.

[7] 刘建成，马贵军，蒋粒新．复合菌固态发酵棉籽粕工艺的初步研究[J]．饲料工业，2011,32(7):32-36.