海南黑山羊CAST基因的时空表达分析
2013-11-30周汉林侯冠彧王东劲徐铁山
管 凇，周汉林，侯冠彧，王东劲，徐铁山
(中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737)
随着人们生活水平的不断提高，消费者对肉的嫩度和肉质方面的要求也越来越高。肉的嫩度是影响肉质的重要因素，因此,如何提高畜禽肉品质已成为畜禽育种工作者的新目标[1]。
根据研究发现，钙蛋白酶系统是一种存在于细胞内的限制性蛋白水解酶，与肉质的嫩度和风味等食用品质密切相关。在肌肉组织中，钙蛋白酶系统控制着肌纤维蛋白的降解，是肌肉蛋白质降解的限速酶，在肌原纤维更新和宰后嫩化中扮演着重要角色[2]，而且在细胞内普遍存在并参与大量的生长和代谢过程[3]。其中，钙调蛋白酶抑制蛋白(caplastatin, CAST)是钙调蛋白酶系统的一种内源抑制剂，它可以识别钙蛋白酶与钙结合引起的构象变化并与之特异性结合，参与肌肉生长过程中蛋白质的更新，在肉用畜禽中显著影响屠宰后肉的嫩度[4]。
由于骨骼肌蛋白质的含量对肉质的影响很大，因而，CAST基因已成为研究肌肉生长和肉质性状的候选基因[5]。目前，针对CAST基因在牛、猪、羊、鸡等畜禽方面的研究，多见其遗传标记多态性与组织学特征、肌纤维性状、肉质性状等的相关性研究[6]，有关CAST基因在畜禽肉品质嫩化过程中的调控机理研究较少。本研究利用实时荧光定量PCR技术，探讨CAST基因在海南黑山羊骨骼肌、心肌、肝脏和脂肪组织中的表达差异及其发育变化规律，以进一步揭示CAST基因的生物学功能及其对肉质的表达调控机理提供了参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用中国热带农业科学院实验羊场的海南黑山羊1、2、3、4月龄公羔和12月龄公羊各三只(相同营养水平，相同饲养环境)屠宰后取心肌、骨骼肌、脂肪和肝脏，置液氮速冻，-80 ℃保存备用。
1.2 主要仪器和试剂
所用主要仪器包括核酸提取仪Maxwell 16(Promega公司)，荧光定量PCR仪(eppendorf)，PCR仪(德国Biometra)，凝胶成像系统(法国VILBER)，紫外分光光度计测；RNA提取试剂盒(Maxwell 16 Total RNA Purification Kit)购自Promega公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM )购自大连宝生物。
1.3 荧光定量PCR
1.3.1 总RNA提取和反转录 利用核酸提取仪提取总RNA，操作步骤按照Maxwell 16 Total RNA Purification Kit试剂盒说明书进行操作，RNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，用紫外分光光度计测其浓度，将每个样品稀释成一致浓度备用。反转录体系为：5×prime ScriptTM Buffer (for Real Time)20 μL，终浓度1×；Prime ScriptTM RT Enzyme Mix I 1.0 μL；Oligo dT Primer (50 pM) 1.0 μL，终浓度20 pmol；Random 6 mers (100 μM) 1.0 μL，终浓度50 pmol；Total RNA 1.0 μL；Rnase Free ddH2O up to 15 μL。反转录条件为：37℃，15 min；85 ℃，5 S。反转录后的cDNA放置-30 ℃ 冰箱保存待用。
1.3.2 引物设计 参照GenBank已知序列，利用Primer5.0设计引物，送上海英俊生物技术有限公司合成，引物信息见表1。
表1 荧光定量RT-PCR所用引物的相关信息Table 1 Real time RT-PCR primer information
注：β-Actin 为内参基因。
Notes：β-Actin used as housekeeping gene.
1.3.3 实时荧光定量 PCR 本试验采用SYBR Green I 染料法进行荧光定量PCR反应，在realplex4型实时荧光定量PCR仪上进行。PCR反应体系为25 μL：其中SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL, 引物(10 pmol/ L)1 μL, cDNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL，95 ℃预热30 s，PCR循环参数为：95 ℃变性5 s，57 ℃退火20 s；72 ℃延伸15 s，42次循环；根据扩增曲线和溶解曲线进行数据分析。
1.4 统计分析
在保证扩增效率的前提下，参照Winer等[7]方法，用2-△△Ct法度量CAST基因的mRNA相对表达量，以β-Actin为内参基因进行标准化校准。所得数据采用SPSS 14.0统计软件One-way ANOVA进行分析。
2 结果与分析
2.1 CAST基因在不同生长时期四种组织中的表达
CAST基因在海南黑山羊不同生长时期四种组织中的mRNA表达变化见图1，结果表明，该基因在12月龄心肌组织中的mRNA表达量极显著高于1、2、3、4月龄；心肌表达模式为：12月龄>2月龄>1月龄>3月龄>4月龄，在1、2、3、4各月龄间，差异不显著(P>0.05)；骨骼肌中mRNA表达模式与心肌的表达模式有所不同，2月龄骨骼肌中mRNA表达量极显著高于1、3、4月龄和12月龄(P<0.01)，但在3、4月龄间的骨骼肌中的mRNA表达量差异不显著(P>0.05)，表达模式为：2月龄>12月龄>1月龄>3月龄>4月龄，该基因在脂肪和肝脏组织中的mRNA表达模式基本一致，即，12月龄>1月龄>2月龄>3月龄>4月龄；12月龄时，脂肪和肝脏中的mRNA表达量极显著高于1、2、3、4月龄(P<0.01)，但在2、3、4月龄间，脂肪和肝脏中的mRNA表达量不存在显著差异(P>0.05)。
图1 CAST基因在海南黑山羊不同生长时期四种组织中的表达变化规律Fig. 1 The developmental changes of CAST mRNA in 4 tissues in different period of Hainan Black Goat
注：不同的字母之间表示差异极显著(P<0.01)，相同的大写字母与小写字母之间表示差异显著(0.01
Note: Different letters mean extreme difference (P<0.01), the same capitalized letters and different lowercases mean significant differences (0.01
2.2 CAST基因在同一生长时期各种组织中的表达差异
CAST基因在同一生长时期各组织中的表达模式见图2。由图2可知，1月龄时，该基因在骨骼肌中的mRNA表达量极显著大于肝脏、心肌和脂肪，表达模式为：骨骼肌>肝脏>心肌>脂肪；2月龄时，该基因骨骼肌中的表达量极显著上升，且极显著大于肝脏、心肌和脂肪(P<0.01)，表达模式为：骨骼肌>心肌>肝脏>脂肪；3月龄和4月龄时，该基因在骨骼肌、肝脏、心肌、和脂肪中的mRNA表达量明显下降，表达量较低，骨骼肌中的mRNA表达量极显著高于其他组织(P<0.01)，脂肪和肝脏之间的mRNA表达量差异不显著(P>0.05)，表达模式为：骨骼肌>肝脏>脂肪>心肌；12月龄时，该基因在心肌、骨骼肌和肝脏中的mRNA表达量极显著上升(P<0.01)，且在心肌和肝脏中的表达量到达最高，在脂肪中的表达量较低。
图2 CAST基因在海南黑山羊不同生长时期四种组织中的表达差异Fig. 2 The differences of CAST mRNA in 4 tissues in the same period of Hainan Black Goat
注：不同的字母之间表示差异极显著(P<0.01)，相同的字母之间表示差异不显著(P>0.05)。
Note: Averages between the different letters means extreme significant difference (P<0.01), averages between the same letters indicate no significant difference (P>0.05).
以上结果提示，CAST基因在山羊各组织中的调节作用广泛，对骨骼肌的影响最大，其他组织的影响较小，特别是对2月龄的未成年羊，该基因在这一时期骨骼肌中的高表达量是否意味着此时是山羊生长速度最快，肉质最好的时期，此结论有待进一步探讨；另外，该基因时空表达规律复杂，不同组织，时空表达规律有所差异，表达量并没有随着月龄的增加呈一直上升或者下降趋势，其中有升有降。该基因在山羊其他生长时期的时空表达规律有待进一步探讨。
3 讨 论
钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因是广泛存在于动物体内的一种钙蛋白酶依赖的特异性抑制剂[8]，研究表明，改变钙蛋白酶-钙蛋白酶抑素系统的活性可以改变肉的嫩度[9]。前人对CAST基因在动物中的表达规律作了大量研究，Barnoy等[10]发现大鼠从胚胎期成肌细胞融合为多核细胞过程中CAST基因的表达量显著降低。Pringle等[11]研究发现CAST基因与μ-calpain的活性比值与牛肉嫩度存在高度相关性。Morgan等[12]研究表明，阉割过的公牛背最长肌中CAST活性显著升高，肌肉蛋白质降解速度显著降低，从而使其具有更快的生长速度和更高的瘦肉率。燕凤等[13]研究结果表明，CAST基因mRNA表达水平对绵羊的肉嫩度、多汁性及大理石纹起负调控作用，绵羊CAST基因在肌肉组织中的mRNA水平随日龄的增加而增加。林亚秋等[14]研究结果显示，CAST基因在九龙牦牛多种组织中均有表达，其中，在心脏组织中表达量最高, 在脂肪组织中表达量最低。
本研究结果表明，CAST基因在未成年羊的骨骼肌中mRNA表达量极显著高于其他组织(P<0.01)，且在2月龄时达到最高水平；成年后在心肌、肝脏和脂肪中的表达量极显著升高(P<0.01)，在骨骼肌中的表达量次之，但在脂肪中的表达量始终相对较低；这一结论与林亚秋等[14]有相似之处。刘安芳等[15]研究结果表明，CAST基因在不同鸡品种的胸肌、心肌、肝、脾、肺、肾、肌胃、脑、小肠、卵巢组织样中均有表达，且在肌肉组组织中表达量显著高于其他组织，其次在肝脏中的表达量也较高。这一观点与本研究中CAST基因在未成年羊中的表达模式相似，以上研究进一步验证了本研究结果的可靠性。另外，该基因在3、4月龄各组织中的mRNA表达量相对较低，且四种组织在3、4月龄间表达差异不显著(P>0.05),此结论需要更多系统的、连续性的数据作为参照至进一步探讨。关于该基因在其他生长时期和其他组织中的表达模式有待进一步研究，推测该基因在不同组织、不同发育阶段的表达特点有所差异。随着对CAST基因的深入研究，如果通过基因调控技术提高或降低CAST在肌肉组织中的表达量来控制CAST的活性，以控制肌原纤维蛋白质的降解，从分子水平上控制肌肉的嫩度，从而达到提高肌肉生长和改善肉质的目的，这对于提高畜禽肉的品质具有十分重要的意义[15]。该试验为进一步研究CAST基因对肉质的表达调控机理提供了参考依据。
参考文献：
[1] 杨志刚,王宝维,王 雷.肉鸡脂肪性状调控基因的研究进展[J].家禽科学,2005(9):40-43.
[2] 李 婧,郭月英,任 霆,等.钙蛋白酶抑制蛋白及CAST基因对肉品质及嫩度的影响[J].食品工业,2013,34(6):141-143.
[3] Croall D E, DeMartino G N. Calcium-activated neutral protease (calpain) system: structure, function, and regulation[J]. Physiol Rev,1991,71(3):813-847.
[4] Kretchmar D H, Koohmaraie M, Mersmann H J. Comparison of proteolytic variables in a lean and obese strain of pig at 2.5 and 7 months[J]. Lab Anim Sci, 1994, 44(1):38-41.
[5] 邱莫寒,鲜凌瑾,张 平.钙蛋白酶系统基因的研究进展[J].安徽农业科学,2009,37(28):13 628-13 631.
[6] 武艳群,吴旧生,赵晓枫,等.猪CAST基因多态性与肌纤维组织学特性及屠宰性状的相关性分析[J].遗传,2007,29(1):65-69.
[7] Winer J ,J ung C K, Shackel I ,et al. Development and validation of real-time quantitative reverse tran-Scriptase-polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro[J]. Anal Biochem, 1999,270 (1): 41-49.
[8] Juszczuk-kubiak E, Wyszyńska-koko J, Wicińska K, et al. A novel polymorphisms in intron 12 of the bovine calpastatin gene[J]. Mol Biol Rep, 2008, 35(1): 29-35.
[9] Geesink G H, Nonneman D, Koohmaraie M. An improved purification protocol for heart and skeletal muscle calpastatin reveals two isoforms resulting from alternative splicing [J]. Arch Biochem Biophys, 1998, 356:19-24.
[10] Barnoy S, Glasner T, Kosower NS. The role of calpastatin (the specific calpain inhibitor) in myoblast differentiation and fusion[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 220(3):933-938.
[11] Pringle T D, Harrelson J M, West R L, et al. Calcium - activated tenderization of strip loin, top sirloin, and top round steaks in diverse genotypes of cattle [J]. J Anim Sci, 2000, 78: 2 615-2 621.
[12] Morgan J B, Wheeler T L, Koohmaraie M, et al, Crouse J D. Meat tenderness and the calpain proteolytic system in longissimus muscle of young bulls and steers[J]. Animal Science, 1993, 71:1 471-1 476.
[13] 燕 凤. 绵羊CAPN1、CAST基因mRNA的发育性表达规律及其对肉品质的影响[D].陕西杨凌：西北农林科技大学,2008.
[14] 林亚秋, 郑玉才, 黄吉芹，等.九龙牦中CAST 基因部分序列的克隆及其表达差异研究[J].西南民族大学学报:自然科学版,2009,35(4):764-767.
[15] 刘安芳，朱 庆，刘益平，等.钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因在鸡不同组织和品种中的表达差异[J].中国农业科学, 2007,40(10):2 331-2 335.
