APP下载

miR-155反义寡核苷酸转染对甲状腺癌细胞迁移、侵袭和MMP-13表达的影响

2013-11-22王娟俞力范钰

江苏大学学报(医学版) 2013年6期
关键词:寡核苷酸反义癌细胞

王娟,俞力,范钰

(1.江苏大学附属医院输血科,江苏镇江212001;2.江苏大学附属医院内分泌科,江苏镇江212001;3.江苏大学附属人民医院肿瘤研究所,江苏镇江212002)

近年来,甲状腺癌发病率逐渐增高,由于发现较晚,部分患者确诊时甲状腺癌出现转移,给临床治疗带来了一定困难。检测肿瘤分子标志物并探讨其相关致病分子机制,将有效改善甲状腺癌诊断的整体水平。

越来越多的研究表明,多种人类肿瘤的发生发展都与微小RNAs的异常表达有着密切关系[1-3]。微小RNAs是RNA信号传导通路中一个极其重要的调控分子,可通过不同表达方式调控肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡等[1]。近年来,很多研究者发现,miR-155在多种实体瘤组织或细胞中高表达,如乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、胰腺导管腺癌(PDAC)等[4-7],且与癌细胞增殖有关。但有关 miR-155在人甲状腺癌体外细胞中的作用研究甚少[8],本课题利用反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotides,AS)下调miR-155的表达,观察反义寡核苷酸对人甲状腺癌BCPAP细胞系生长侵袭的影响,探讨miR-155在甲状腺癌发病中可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人甲状腺癌BCPAP细胞系购自南京凯基生物科技发展有限公司,本院组织细胞生物库冻存;DMEM及胎牛血清(美国Gibco公司);细胞培养板和Transwell板(美国Coring公司);细胞裂解缓冲液及发光底物(美国Promega公司);基质胶(美国BD公司)。人基质金属蛋白酶-13(MMP-13)ELISA试剂盒(美国Calbiochem公司)。

1.2 反义寡脱氧核苷酸转染

使用DMEM培养液在37℃,5%CO2的常规条件下培养人甲状腺癌BCPAP细胞。AS-miR-155序列:5'-TCCCCTATACACGATTAGCATTAA-3';无义寡核苷酸(oligodeoxyribonucleotides,ODN)序列:5'-ATCTCATACTACACTTGAACACT-3',依据转染试剂说明书操作,加入等体积PBS以建立空白对照组。

1.3 实时荧光定量PCR法检测miR-155 mRNA的表达

抽提细胞总RNA并精制,反转录为cDNA。定量 PCR(miR-155)上游引物:5'-CGCGCTTAATGCTAATCGTGA-3';下游引物:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3',长度为 62 bp。GAPDH(作为内参)上游引物:5'-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3';下游引物:5'-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3',长度为115 bp。反应循环条件及计算方法参照文献[9]进行。

1.4 划痕法检测癌细胞迁移能力

①先在细胞培养板背后均匀地划横线,大约每隔1 cm一道,横穿过孔。②培养细胞至对数生长期,消化并计数、使用培养基配制成浓度为8×105个/mL的细胞悬液。培养板中每孔加入1 mL细胞悬液,置于37℃,5%CO2培养箱中培养直至细胞铺满单层;③ 用100 μL移液枪头沿培养板底部呈“一”字形划线;④弃去培养基,用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞;⑤ 细胞培养板置于37℃,5%CO2培养箱中培养24 h后拍照,计算间距。

1.5 Transwell检测癌细胞侵袭力

参照文献[9]的方法,使用倒置显微镜(×100)观察穿过聚碳酸酯膜微孔的细胞数,在每张膜的中央及周围部分随机取3个视野,计数每个视野内的穿膜细胞数。

1.6 ELISA法检测癌细胞MMP-13含量

收集各组细胞上清液,采用MMP-13 ELISA试剂盒通过夹心酶联免疫方法测定MMP-13含量,具体步骤参照说明书。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组转染效果的比较

AS-miR-155组转染后,BCPAP细胞miR-155 mRNA表达水平明显低于空白对照组和无义ODN组(P<0.05)。结果显示,所构建的反义寡核苷酸明显下调了BCPAP细胞中miR-155 mRNA水平(图1)。

图1 miR-155反义寡核苷酸转染对miR-155 mRNA表达的影响

2.2 As-miR-155转染对癌细胞迁移力的影响

划痕试验结果显示,空白对照组和无义ODN组间距分别为(532±26)μm 和(518±22)μm,而转染AS-miR-155组间距为(785±28)μm,AS-miR-155组间距明显大于对照组和无义ODN组(F=172.461,P=0.000)。结果提示AS-miR-155组细胞迁移速度明显变慢。

2.3 AS-miR-155转染对癌细胞侵袭的影响

应用Transwell检测癌细胞侵袭能力,结果显示平均每个视野穿膜细胞数空白对照组为43.8±2.6,无义 ODN 组为43.6 ±2.2,而转染 AS-miR-155组为18.9±1.8。AS-miR-155组穿膜细胞数明显少于对照组和无义 ODN 组(F=598.212,P=0.000)。结果提示,下调miR-155表达后癌细胞的侵袭力受到明显抑制。见图2。

图2 miR-155反义寡核苷酸转染对癌细胞侵袭的影响(×100)

2.4 AS-miR-155转染对癌细胞MMP-13水平的影响

ELISA结果显示,空白对照组和无义ODN组MMP-13含量分别为(85.2±2.8)pg/mL和(84.8±2.5)pg/mL,而转染 As-miR-155组 MMP-13含量为(35.6±1.5)pg/mL。AS-miR-155 组 MMP-13含量明显小于对照组和无义ODN组(F=689.28,P=0.000)。结果提示,下调miR-155的表达可明显抑制MMP-13的水平。

3 讨论

微小RNAs是一类单链小分子RNA,长约20~24 nt。其特点为短序列、非编码且具有调控力[1],其对基因表达的反向调控主要是通过与靶基因完全或不完全互补结合完成。大量研究表明,多种肿瘤的发生发展都与微小RNAs的异常表达有关[1-3]。微小RNAs的发现和应用为乳腺癌、大肠癌、甲状腺癌、宫颈癌等恶性肿瘤的基因诊断和治疗提供了一个新的靶点。

侵袭、迁移与增殖是转移性甲状腺癌治疗失败及预后不佳的最常见原因,也是肿瘤细胞远处转移的重要步骤。因此,积极寻求与甲状腺癌迁移和侵袭能力相关的分子标志物,探讨其内在发生及发展机制,对甲状腺癌的诊疗水平的提高有极大帮助。研究数据已经发现,miR-155高表达与许多实体瘤如乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、胰腺导管腺癌等[4-7]的生物学表型密切相关。但在甲状腺癌细胞迁移、侵袭中miR-155所起作用目前尚有待进一步明确。

本研究通过反义寡核苷酸下调miR-155的表达,结果显示miR-155表达下调后的BCPAP细胞迁移速度变慢,穿过Transwell小室聚碳酸酯膜的能力明显下降,与空白对照组及无义ODN组比较,差异有统计学意义。

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分的降解是肿瘤的浸润与转移的关键过程。研究显示,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)能降解ECM。按照底物特异性,人类MMPs主要分为明胶酶、间质胶原酶、基质溶解素、基质溶解因子、基质金属蛋白质酶及其他6类。MMPs主要功能是降解一种或多种ECM成分;调控血管形成;通过与整合素的相互活化而加强细胞间的黏附作用。MMP-13是MMPs重要成员,许多学者发现,MMP-13在许多恶性肿瘤包括甲状腺癌细胞中高表达[10-11],且与甲状腺癌侵袭有关[12]。本研究采用ELISA检测发现,AS-miR-155转染组MMP-13含量明显低于空白对照组和无义ODN组。

本研究表明,下调miR-155表达水平,可使甲状腺癌细胞的迁移和侵袭能力得到明显抑制。而MMP-13被抑制是miR-155调控甲状腺癌细胞迁移和侵袭能力的重要机制之一。因此,miR-155在人甲状腺癌细胞迁移侵袭过程中发挥着重要作用,有望成为甲状腺癌基因治疗中颇具前景的候选靶点。

[1] Tricoli JV,Jacobson JW.MicroRNA:Potential for Cancer Detection,Diagnosis,and Prognosis[J].Cancer Res,2007,67(10):4553 -4555.

[2] Leeman MF,McKay JA,Murray GI.Matrix metalloproteinase 13 activity is associated with poor prognosis in colorectal cancer[J].J Clin Pathol,2002,55(10):758 -762.

[3] Lederle W,Hartenstein B,Meides A,et al.MMP13 as a stromal mediator in controlling persistent angiogenesis in skin carcinoma[J].Carcinogenesis,2010,31(7):1175-1184.

[4] Pellegrino L,Jacob J,Roca-Alonso L,et al.Altered expression of the miRNA processing endoribonuclease Dicer has prognostic significance in human cancers[J].Expert Rev Anticancer Ther,2013,13(1):21 -27.

[5] Faraoni I,Antonetti FR,Cardone J,et al.miR-155 gene:a typical multifunctional microRNA[J].Biochim Biophys Acta,2009,1792(6):497 -505.

[6] Tili E,Croce CM,Michaille JJ.miR-155:on the crosstalk between inflammation and cancer[J].Int Rev Immunol,2009,28(5):264 -284.

[7] Mattiske S,Suetani RJ,Neilsen PM,et al.The oncogenic role of miR-155 in breast cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2012,21(8):1236 -1243.

[8] Bakirtzi K,Hatziapostolou M,Karagiannides I,et al.Neurotensin signaling activates microRNAs-21 and-155 and Akt,promotes tumor growth in mice,and is increased in human colon tumors[J].Gastroenterology,2011,141(5):1749 -1761.

[9] Wang X,Tang S,Le SY,et al.Aberrant expression of oncogenic and tumor-suppressive microRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth[J].PLoS ONE,2008,3(7):e2557.

[10] Szafranska AE,Davison TS,John J,et al.MicroRNA expression alterations are linked to tumorigenesis and nonneoplastic processes in pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Oncogene,2007,26(30):4442 -4452.

[11] Nikiforova MN,Tseng GC,Steward D,et al.MicroRNA expression profiling of thyroid tumors:biological significance and diagnostic utility[J].Clin Endocrinol Metab,2008,93(5):1600-1608.

[12] Fan Y,Zhang YL,Wu Y,et al.Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses invasion through inducing anoikis in human colon cancer cells[J].World J Gastroenterol,2008,14(3):428 -434.

猜你喜欢

寡核苷酸反义癌细胞
粗寡核苷酸的纯化方法现状及进展
一种提高变体库多样性的寡核苷酸设计方法
认识反义词
反义疑问句小练
癌细胞最怕LOVE
假如吃下癌细胞
这山望着那山高
美丽疗法打败癌细胞
寡核苷酸药物及寡核苷酸制备技术研究进展
癌细胞最怕Love