腹泻犊牛大肠杆菌血清型抗菌药物耐药性耐药基因鉴定及脉冲场凝胶电泳分型

张 陆，蒋 月，盛鹏飞，张秀英

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030；2.辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁 锦州121000）

目前大肠杆菌耐药性问题是全球关注的热点，监测动物源大肠杆菌耐药性具有重要的公共卫生意义［1］。近年来关于动物源大肠杆菌耐药性的报道很多，但主要集中在猪、鸡源大肠杆菌，牛源大肠杆菌的报道相对较少。本试验侧重于肠道来源的致病性大肠杆菌，检测了2011年分离自哈尔滨周边地区的犊牛腹泻致病性大肠杆菌的血清型、基因分型和对常用抗菌药物的敏感性，掌握该地区致病性大肠杆菌的流行现状。

1 材料与方法

1.1 主要材料 营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂、水解酪蛋白琼脂（MH琼脂），购自北京奥博星生物技术有限责任公司；12种药敏纸片和大肠杆菌生化鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；PCR引物由宝生物工程（大连）有限公司合成；rTaq酶、DL－2 000DNA Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司；药敏质控菌大肠杆菌ATCC25922，购自中国兽医药品监察所。

1.2 致病性大肠杆菌O血清群鉴定 在哈尔滨周边地区13个养牛场共采集腹泻犊牛肛拭子263份，大肠杆菌的分离鉴定及菌株的致病性鉴定参照文献［2］。将鉴定出的致病性菌株邮寄至中国兽医药品监察所完成O血清型鉴定。

1.3 药敏试验 采用 KB法，依据CLSI（2007）标准测试及判定各菌株对阿莫西林/棒酸（AMX/CA）、头孢噻呋纳（CTF）、链霉素（STR）、庆大霉素（GEN）、新霉素（NEO）、四环素（TET）、多西环素（DOX）、氟苯尼考（FLR）、恩诺沙星（EN）、诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIP）、复方新诺明（TSM）的敏感度。

1.4 耐药基因的PCR检测 采用PCR方法检测所有致病性大肠杆菌中的：超广谱β－内酰胺酶基因blaSHV、blaCTX－M、blaTEM、blaOXA；氨基糖苷酰基转移酶基因aadA1、aac（3）－Ⅱ；四环素类耐药基因tetA、tetB，氟苯尼考耐药基因floR。PCR扩增引物参照文献［3］。设ATCC25922为阴性对照。

1.5 脉冲场凝胶电泳（PFGE） 利用PFGE检测上述致病性样本之间的亲缘关系。随机选择了来自不同地区的16株耐药表型相同（AMC－STR－TETSXT－DOX）的菌株进行PFGE分析，XbaI消化处理菌株染色体DNA，具体方法参照文献［4］，电泳条件为120℃，脉冲切换时间为2.2s～54.0s，电泳时间19h，电压6V，温度14℃，结果采用BioNumerics 4.0软件进行聚类分析。

2 结果

2.1 致病性大肠杆菌的分离鉴定结果 共采集肛拭子263份，鉴定出大肠杆菌187株，将187株大肠杆菌培养物接种小鼠后，72h内26株导致小鼠死亡，因此致病性大肠杆菌为26株。

2.2 血清型鉴定结果 26株分离细菌全部被鉴定出O血清型，其中O2610株、O785株、O154株、O863株、O82株、O91株、O201株，见表1。

表1 26株致病性大肠杆菌O血清型分布、多重耐药表型及携带耐药基因类型统计

2.3 大肠杆菌耐药性监测结果 26株致病性大肠杆菌全部为耐药菌，其中对阿莫西林－棒酸、链霉素、四环素、复方新诺明的耐药率达到了100%，对多西环素的耐药率为96.2%，对头孢噻呋、氟苯尼考、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的耐药率分别为19.2%、19.2%、11.5%、7.7%和3.8%，而对庆大霉素和新霉素全部敏感。

2.4 致病性大肠杆菌的耐药表型和耐药基因型全部26株分离菌的多重耐药率达到了100%，其中最少为4耐，最多为9耐，共有8种耐药表型，优势表型是 AMX－STR－TET－TSM－DOX。而耐药基因blaTEM、blaCTX－M、aadA1、aac（3）－II、tetA、tetB、floR的检出率分别为 84.6%、19.2%、73.3%、11.5%、69.2%、38.5%、19.2%。具体耐药表型及耐药基因携带情况见表1。

2.5 脉冲场凝胶电泳结果 通过电泳图谱的聚类分析结果（图1）可见，部分不同地区来源的分离株具有相同的基因谱型，例如D2、H6、Z16与Z20，S11、S12与A3，S8与H9。这说明在哈尔滨周边不同地区之间存在着相同致病性菌株的克隆传播。而且将此结果与菌株血清型测定结果相比较，发现PFGE图谱一致的菌株血清型均相同，但血清型相同的大肠杆菌PFGE不一定相同。

3 小结与讨论

本试验共鉴定出26株致病性大肠杆菌，其主要流行的血清型为 O26（38.5%）、O78（19.2%）和 O15（15.4%），这与文献报道［5］牛致病性大肠杆菌的主要血清型为 O8、O9、O15、O20、O26、O35、O78、O101、O115、O117、O137比较符合。通过PFGE图谱可得出哈尔滨地区存在着相同致病株的克隆传播。而且将PFGE结果与菌株的血清型对比，可发现PFGE图谱一致的菌株血清型均相同，但血清型相同的大肠杆菌PFGE不一定相同，这与中国兽药监察所张媛等［6］得出的结论“PFGE相似率在85%以上的致病性大肠杆菌血清型均相同，但血清型相同的大肠杆菌PFGE不一定相同”相似。

26株致病性大肠杆菌对12种药物的耐药性呈现两极分化，对阿莫西林/棒酸、链霉素、四环素、复方新诺明的耐药率极高达到了100%，对多西环素的耐药率也达到了96.15%，此结果高于国内相关报道［1，7］。而相反，本试验对庆大霉素、新霉素的耐药率为0，这个数据低于国内所有相关报道。上述情况表明，不同地区的分离菌的耐药性有较大差异，说明不同地区用药情况和特点不同。

在26株致病性大肠杆菌中，7种耐药基因检出率基本上与报道［8］数据和菌株的耐药表型相一致。特殊情况在于介导庆大霉素耐药的aac（3）－Ⅱ基因，特点是除耐药株外，在敏感株中也检出该基因，分析原因可能是由于环境选择压力下降，导致基因不表达或表达不完全［9］，有待进一步研究。

［1］ 赖婧，刘洋，汪宇，等.800株不同动物源大肠杆菌的耐药性监测［J］.中国兽医杂志，2011，47（4）：12－14.

［2］ 苏海峰，蒋月，徐国锋，等.哈尔滨周边地区猪源致病性大肠杆菌耐药性分析［J］.中国兽医杂志，2012，48（6）：46－49.

［3］ Smith M G，Jordan D，Chapman T A，etal.Antimicrobial resistance and virulence gene profiles in multi－drug resistant enterotoxigenic Escherichia coli isolated from pigs with post－weaning diarrhoea［J］.Vet.Microbiol，2010（145）：299－307.

［4］ Wang X M，Jiang H X，Liao X P，etal.Antimicrobial resistance，virulence genes，and phylogenetic background in Escherichia coli isolates fromdiseased pigs ［J］.FEMS Microbiol Lett，2010，306：15－21.

［5］ 方光远，张姝，张玉红，等.腹泻犊牛大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验［J］.中国兽医杂志，2008，44（10）：33－34.

［6］ 张媛，郭鑫，蒋玉文，等.猪源大肠杆菌分离、血清型鉴定及脉冲场凝胶电泳分型［J］.畜牧与兽医，2012（9）：19－24.

［7］ 罗甜甜，王仲兵，雷宇平，等.山西省北部地区舍饲犊牛大肠杆菌病主要病原的分离和耐药性调查研究［J］.检验监测，2012，29（3）：42－44.

［8］ 赵红霞.奶牛子宫内膜炎致病大肠杆菌的分离、鉴定及耐药性研究［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学博士学位论文，2008，31－42.

［9］ 顾兵，童明庆，赵文君，等.铜绿假单胞菌多重耐药机制研究［J］.中华检验医学杂志，2006，29（12）：1097－1102.