酮病和健康奶牛血清中触珠蛋白和血清淀粉样蛋白A浓度的比较研究

郝景锋，王建国，朱晓岩，杨文涛，丁洪岩，史晓霞，宋玉祥，邓清华，赵晨旭，刘兆喜，王 力，赵 权，刘国文

（1.吉林农业科技学院动物医学学院，吉林 吉林132101；2.吉林农业大学研究生院，吉林 长春130118；3.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春130062）

急性期反应蛋白（acute phase serum protein response，APP）是一类公认的炎症、外伤以及其他病理学状态的指示蛋白，这类蛋白对于家畜健康状态的监测是十分重要的，并且已经受到广泛关注［1］。急性期反应蛋白的生物学功能包括：抑制蛋白酶的活性；清除异物以及坏死组织；促进自由基排出；促进细胞修复，增强细胞趋化性，促进吞噬作用等［2］。国外研究表明，在炎症的急性阶段，血清中急性期反应蛋白的浓度能从2、3倍迅速增至数百倍［3］。触珠蛋白（haptoglobin，HP）和血清淀粉样蛋白 A（serum amyloid A，SAA）是大多数动物最主要的急性期反应蛋白。

奶牛酮病是以能量负平衡、脂肪动员、肝内脂肪摄入过多为主要病理学基础，以低血糖、高血酮为主要血液生化特点的营养代谢性疾病，引起体内糖和脂肪代谢紊乱，目前的研究初步认为，酮病的发生对肝脏会产生不同程度的损伤，但有关酮病奶牛血清中HP和SAA有何变化至今尚未报道。

本试验运用ELISA方法，旨在通过对酮病奶牛和健康奶牛血清中触珠蛋白和淀粉样蛋白A浓度测定，为更加深入地研究奶牛酮病发病机制并对该病做出及时诊断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点 2012年9月于长春市某奶牛场取样，在实验室内进行分析。

1.2 试验材料

1.2.1 奶牛选择及分组 长春市某奶牛养殖场，采用配对比较的方法，将胎次、产奶量、年龄以及体况相近荷斯坦奶牛20头分为2组，以血清中β－羟丁酸 （BHBA）、葡萄糖（Glucose）和非酯化脂肪酸（NEFA）浓度作为奶牛酮病的诊断依据（BHBA＞1.2mmol/L；glucose＜2.5mmol/L；NEFA＞0.5 mmol/L），最终选定10头奶牛为酮病组，另外选择10头奶牛作为对照组（健康组）。日粮配给按照围产期奶牛营养需要标准供应，TMR饲养技术饲喂。

1.2.2 主要试剂与仪器 牛触珠蛋白相关蛋白ELISA试剂盒（产品编号：E11H0103），上海蓝基生物科技有限公司；牛血清淀粉样蛋白A ELISA试剂盒（产品编号：E11S0228），上海蓝基生物科技有限公司；7170A全自动生化分析仪，日本 HITACHI公司。TGL－16C型台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；酶标仪为美国Bio－TEK 产品，型号为ELX800；电子天平购自日本SHIMADZU。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集 清晨饲喂前通过颈静脉采集血液样品，血样在室温中静置40min，3 000r/min离心15min，收集血清，于－20℃冰箱保存待测血清中的HP和SAA含量。

1.3.2 病牛的检测 参照王建华方法配制酮粉［4］，即亚硝基铁氰化钠1g，硫酸铵20g，无水碳酸钠20g。按以上比例准确称量各试剂分别研细，充分混合后干燥保存。操作时取上述粉末少许在载玻片上，加乳汁1滴，如出现紫色为阳性反应。

1.3.3 血样 β－羟丁酸、非酯化脂肪酸和葡萄糖含量采用β－羟丁酸检测试剂盒、血液非酯化脂肪酸测定试剂盒和葡萄糖测试试剂盒测定，按试剂盒说明书操作。

1.4 临床酮病的诊断标准 本试验在现场采用酮粉法对牛乳汁进行初步检测，对受试牛颈静脉采集血样。酮粉法检测的结果判定根据颜色变化，颜色无变化视为阴性，变紫色者初步确定为阳性。本试验酮病奶牛的判定标准为血清中：BHBA＞1.2 mmol/L；glucose＜2.5mmol/L；NEFA ＞0.5 mmol/L［5］。

1.5 数据统计分析 应用SPSS 13.0软件分析数据，酮病奶牛和健康奶牛血清中各指标的分析用ONE－WAY ANOVA（方差分析），试验结果用±SD表示。

2 结果

2.1 奶牛胎次、体重和产奶量 所选择的奶牛胎次相当，符合试验要求，酮病奶牛体重和产奶量显著低于健康奶牛（P＜0.05）。见表1。

表1 酮病和健康奶牛胎次、体重和产奶量 （mean±SD）

2.2 血清中BHBA、NEFA和血糖含量 如表2所示，与健康奶牛相比，血清中BHBA和NEFA浓度显著高于健康奶牛（P＜0.05）；血清中葡萄糖浓度显著低于健康奶牛（P＜0.05）。

表2 酮病和健康奶牛血清中BHBA、NEFA和血糖浓度测定结果 （mean±SD）

2.3 血清中HP和SAA含量测定结果 如图1显示，酮病奶牛血清中HP和SAA浓度均极显著高于对照组健康奶牛（P＜0.01）。

3 讨论

根据试验结果可以看出（图1），酮病奶牛的HP浓度显著高于健康奶牛，表明酮病发生时能够促进触珠蛋白的生成，触珠蛋白又称结合珠蛋白，是血清α2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白［6］，主要存在于多数哺乳动物、人类的血液以及其他体液中，能够与游离的血红蛋白（Hb）相结合，形成 HP－Hb复合物，该复合物由于分子量较大，不能透过肾小球滤膜而经尿液排出，故可保护亚铁血红素防止其漏失，从而避免由于溶血导致的肾脏受损。触珠蛋白作为一种急性期反应蛋白，在参与机体抗感染、损伤组织的修复以及维持内环境稳定等方面起着重要作用［7］。近年研究结果表明，触珠蛋白与肝脏疾病联系密切，因此触珠蛋白日益成为广大肝病研究者研究的重点，触珠蛋白的表达主要受白介素－6（IL－6）的调节，当奶牛由于酮病对机体产生应激，内毒素刺激白细胞产生白介素－1（IL－1）和白介素－6（IL－6），IL－1能够促进胰高血糖素以及糖皮质激素分泌增加，其中胰高血糖素能够增强细胞的环腺苷酸水平，使肝脏的合成功能增强，而IL－6也能促进触珠蛋白的合成，肝细胞膜存在大量触珠蛋白受体，与之相结合，从而促进其合成。触珠蛋白由于含有不同类型的轻链，具有遗传多态性，在肝脏合成和降解，并受前列腺素、激素以及细胞因子等的调节，具有广泛的生物学功能，可能是一种重要的调节蛋白。

另外，结果表明，酮病奶牛的SAA浓度相比健康奶牛显著升高，可见酮病能够促进血清淀粉样蛋白A的产生，血清淀粉样蛋白是由同一簇基因编码的一组多形性蛋白，它们存在于各种禽类和哺乳动物血液中。作为一种肝脏来源的高密度脂蛋白（HDL）相关载脂蛋白，血清中SAA的浓度可在对各种损伤包括创伤、炎症、感染以及肿瘤时升高1 000倍。SAA主要由肝细胞合成，当酮病发生时，肝脏不同程度受到损伤，在应激条件下，巨噬细胞释放的白细胞介素（IL）－1和肿瘤坏死因子（TNF）使IL－6分泌增加，后者刺激肝细胞产生急性时相蛋白，且受糖皮质激素调控，大量的SAA可以用替换载脂蛋白A－Ⅰ与高密度脂蛋白（HDL）相结合，从而形成SAA/HDL复合体，而HDL可以运输胆固醇，因此酮病造成的胆固醇增加可以促进血清中SAA浓度增高。综上所述，奶牛发生酮病时作为急性期蛋白的触珠蛋白以及淀粉样蛋白A的浓度在应激作用下显著升高，提示在奶牛发生酮病时可能存在炎症反应等急性过程，进一步研究还需对其机理进行深入研究。

［1］ Kushner lière′s clinical rheumatology［J］.1994，8（3）：513－530.

［2］ 王璇，李爱敏，初清.感染性疾病急性期反应蛋白的研究进展［J］.山东医药，2010（45）：105－106.

［3］ Heegaard Pmh，Godson D L，TOUSSAINT MJM，etal.The acute phase response of haptoglobin and serum amyloid A（SAA）in cattle undergoing experimental infection with bovine respiratory syncytial virus［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2000，77（1）：151－159.

［4］ 王建华.兽医内科学［M］.4版.北京：中国农业出版社，2010：228－229.

［5］ Li P，Li X，Fu S，etal.Alterations of fatty acidβ－oxidation capability in the liver of ketotic cows［J］.Journal of dairy science，1995（4）：1759－1766.

［6］ 杨宇，李庆章，吕英.结合珠蛋白在奶牛乳房炎研究中的进展［J］.中国奶牛，2010（10）：47－49.

［7］ 谭丽娜，黄进华.结合珠蛋白的研究进展［J］.国际病理科学与临床杂志，2006（1）：43－47.