中国白兔IL－6基因的克隆与序列分析

张夏兰，陈 军，王红宁，杨 鑫，张安云

（1.四川农业大学动物科学院，四川 雅安625014；2.四川大学生命科学学院动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，四川 成都610064；3.重庆市巴南区动物疫病预防控制中心，重庆 巴南401320；4.重庆市动物卫生监督所，重庆 巴南401147）

白介素6是已知的功能最广泛的细胞因子，作为一种重要的免疫调节剂，在细胞免疫中有广谱性，在动物疾病的预防、治疗和构建基因工程疫苗中显示出广阔的应用前景，在家兔上做白介素6的研究实属必要。本试验基于IL－6在免疫学方面特有的生物学活性，根据GenBank上登录的兔IL－6的基因序列，结合人IL－6的基因序列，设计引物，从中国白兔的淋巴细胞RNA中扩增出IL－6基因。本试验在国内尚属首次，具有一定学术价值和应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料 1～2月龄的中国白兔，购自四川某肉兔场。RNA抽提试剂盒、反转录酶AMV、Oligo（dt）、RNA 酶 A、Taq酶、d NTP 、EcoRⅠ、HindⅢ、RNA酶抑制剂、T连接酶、质粒抽提试剂盒、载体pMD18－T、DNA Marker DL－2 000，均购自宝生物工程（大连）有限公司；ConA，购自Sigma公司；营养液1640，购自天泰公司，兔淋巴细胞分离液，购自天津市灏泽生物制品科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 兔淋巴细胞的分离及总RNA的提取 无菌采取兔外周血，肝素抗凝，在无菌条件下加入等量的PBS稀释兔血，用兔淋巴细胞分离液分离兔PB－MC.兔淋巴细胞总RNA的提取是按照Bio Spin RNA抽提试剂盒操作说明书进行。

1.2.2 引物的设计与合成 根据GenBank上登录的兔的白介素6序列（序列号：AF169176），设计1对引物，在引物的两侧分别加上酶切位点HindⅢ和EcoRⅠ，并在没酶切位点上添加保护碱基。引物序列如下：

上 游： 5′－AGCAAGCTTATGAACTCCTTCACAAGCG－3′；下游：3′－GGACAGGTAACCTGTGTATTCTTAAGTAA－5′。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，预期产物片段长度约为726bp。

1.2.3 中国白兔IL－6基因RT－PCR 扩增 30μL的RT反应体系：总 RNA 9μL，10mmol/L dNTP 2μL，Oligo dT 1μL，RNAsin 0.5μL混匀，70℃4 min，再加入5×RT Buffer 4μL，Mg2＋3μL，反转录酶AMV 0.5μL，RNAsin 0.5μL，混匀后按如下程序进行 RT反应：30℃10min，42℃45min，95℃5min。反应产物进行PCR反应。PCR的反应体系为50μL：10×PCR Buffer 5μL，Mg2＋3μL，10mm d NTP 1μL，上游引物（30pmol/L）1μL，下游引物（30pmol/L）1μL，反转录产物c DNA 1 μL，TaqDNA聚合酶0.3μL，H2O 补至50μL，混匀，95℃预变性5min后按以下条件进行PCR反应：94℃30s，54℃50s，72℃60s，35个循环之后，72℃延伸10min，4℃10min后结束反应。取5μL反应产物点样于1%琼脂糖凝胶电泳，80V电泳30 min，在凝胶成像系统上观察结果并拍照。

1.2.4 中国白兔IL－6的克隆及鉴定 PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，参照Marker DL－2 000切取并回收目的条带，按常规方法将目的片段连入载体pMD18－T，转化JM109宿主菌，用菌落PCR、重组质粒酶切及重组质粒PCR筛选阳性质粒。将阳性质粒送往宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定。

1.2.5 序列分析 应用DNASRAR软件，将测得序列，与GenBank上登载的世界其他5个品种的兔IL－6的核苷酸序列比较，探讨中国白兔IL－6的变异规律。

2 结果

2.1 兔IL－6基因的RT－PCR扩增结果 从ConA诱导的兔外周血淋巴细胞中分离RNA后，应用RT－PCR方法扩增得到的约750bp的条带，其大小与上下游引物涵盖的兔IL－6核酸序列长度一致（图1）。

2.2 兔IL－6基因的克隆与鉴定 将PCR纯化产物与pMD18－T载体连接后，并转化E.coliJM109感受态细胞，在37℃培养箱培养12h后，用转化子作菌落PCR鉴定，结果扩增出约750bp大小的一条带（见图1）。

菌落PCR阳性转化子质粒，用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切鉴定，结果具有与目的片段大小一致的电泳带（见图1），表明RT－PCR产物成功地亚克隆到pMD18－T载体上。

图1 兔IL－6RT－PCR及质粒pMD－IL－6鉴定

2.3 序列分析 经序列测定，扩增出的基因片段长726bp（见图2），共编码241个氨基酸，与欧洲兔（Oryctolagus cuniculus）IL－6基因（AF169176）同源性为100%，从而证明了本研究成功的克隆出了中国白兔IL－6基因。中国白兔IL－6与GenBank上登录的白尾野兔、高山白尾野兔、加利福利亚黑尾长腿野兔和白尾长腿野兔的IL－6的基因序列同源性比较结果显示，其种间的同源性为84.9%～91%，见图2。进化树分析结果表明，本研究所用的中国白兔与欧洲兔的亲源性最近，与加利福利亚黑尾长腿野兔的亲源性最远。详细情况见图3。

远端序列比较发现，相对于其他4种兔的IL－6基因序列，欧洲兔和中国白兔在通常的终止子的地方有特征性的突变，导致欧洲兔和中国白兔IL－6基因序列终止密码子位于延长81bp的下游区。

3 讨论

白介素6是一种多功能细胞因子，研究表明，白介素6具有疫苗分子佐剂和抗生素替代物的潜能。中国白兔IL－6基因序列，与欧洲兔IL－6的基因序列相同，相对于GenBank上登录的其他四种野兔的IL－6基因，其同源性差异较大。由于在通常的终止子的地方有变异，下一个终止密码子位于延长81 bp的下游区，故中国白兔IL－6基因序列3＇端的编码区有27个氨基酸的延长。研究发现［1］，家兔和野兔这两个谱系完全不同，家兔来自于混合家兔谱系实验兔，野兔是通过野外铺捉得来的，而这些野兔是一百多年前，最初的欧洲兔由于生活史的扩散，释放到澳大利亚。两种棉尾兔属和两种野兔属，都来自北美而不是欧洲，故其IL－6基因在通常的位置出现了常见的终止子。因此，IL－6在中国白兔和欧洲兔上突变的终止子具有种的特异性，可推断中国白兔和欧洲白兔有很近的亲缘关系，可能来自相同的谱系。

兔IL－6蛋白质羧基端延伸27个氨基酸的影响不得而知。学者们提出六步格的白介素6受体复合物的模式，这个复合物由2个三聚物组成，包含IL－6，IL－6R，和gp 130单个分子［2－5］，指出IL－6分子的氨基和羧基末端位于复合物的外缘。虽然接近羧基端的几个残基对结合IL－6受体是决定性的［6－7］，但是一个延伸的羧基端将干扰这些相互作用是不太可能的。研究显示［8－9］，鼠IL－6 羧基端3个和5个残基的小延长并未影响其生物学活性。

［1］ Chapman J A，Flux J E C.Introduction and overview of the lagomorphs in rabbits，hares and pikas［J］.Status Survey and Conservation Action Plan，IUCN，Gland，Switzerland，2012，1－6.

［2］ Ward L D，Howlett G J，Discolo G，etal.High affinity interleukin－6receptor is a hexameric complex consisting of two molecules each of interleukin－6，interleukin－6receptor，and gp－130［J］.Biol Chem ，1994，269：23286－23289.

［3］ Simpson R J，Hammacher A，Smith D K，etal.Interleukin－6 structure－function relationships［J］.Protein Sci，1997，6：929－955.

［4］ Somers W，Stahl M，Seehra J S.A crystal structure of interleukin 6：implications for a novel mode of receptor dimerization and signalling［J］.EMBO ，1997，16：989－997.

［5］ Fontaine V，Savino R，Arcone R，etal.Involvement of the Arg179in the active site of human IL－6［J］.Eur Biochem ，1993，211：749－755.

［6］ Savino R，Lahm A，Giorgio M，etal.Saturation mutagenesis of the human interleukin6receptor binding site：implications for its three dimensional structure［J］.Proc Natl Acad Sci USA ，1993，90：4067－4071.

［7］ Neipel F，Albrecht J C，Ensser A，etal.Human herpesvirus 8encodes a homolog of interleukin－6［J］.Virol，1997，71：839－842.

［8］ Burger R，Neipel F，Fleckenstein B，etal.Human herpesvirus type 8interleukin－6homologue is functionally active on human myeloma cells［J］.Blood，1998，91：1858－1863.

［9］ Barouch D H，Santra，Steenbeke T D，etal.Augmentation and suppression of immune responses to an HIV－1DNA vaccine by plasmid cytokine/Ig administration［J］.Journal of Immunology（Baltimore），1998，161：1875－1882.