耐药金黄色葡萄球菌gyrA基因突变与中药耐药抑制剂的回复突变研究

游思湘，孟海波，符晨星，瞿俊勇，刘湘新

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙410128；2.湖南农业大学动物科技学院，湖南 长沙410128）

氟喹诺酮类药物对金黄色葡萄球菌发挥抗菌作用的靶位是拓扑异构酶Ⅳ和DNA旋转酶，因此将DNA旋转酶基因和拓扑异构酶Ⅳ基因统称为药物靶位酶基因，这些基因的突变引起靶位酶结构的改变，可使金黄色葡萄球菌逃逸氟喹诺酮类药物的杀灭作用而产生耐药［1－2］。为了探讨金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮类的耐药性与gyrA基因突变的关系及中药耐药抑制剂－复方黄连制剂对耐药金黄色葡萄球菌gyrA基因的影响，选取金黄色葡萄球菌敏感标准株ATCC29213，采用人工逐步诱导方法获得MIC值为64μg/mL、128μg/mL和256μg/mL的耐药突变株。PCR扩增金黄色葡萄球菌敏感菌标准株、耐药株和复方黄连制剂处理的耐药株gyrA基因，产物回收纯化后送测序公司测序。用DNA－sis软件分析测序结果，通过比较3种菌株的gyrA基因碱基序列和氨基酸序列差异，找出细菌的耐药与gyrA基因碱基和氨基酸序列突变的关系及复方黄连制剂是否具有回复突变作用，以便从分子水平初步探讨中药耐药抑制剂－复方黄连制剂的耐药逆转分子机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料 复方黄连制剂：含生药1g/mL，由湖南农业大学动物医学院药学系制备，该制剂各指标符合《中国药典》规定。诺氟沙星原料药：由湖南农业大学动物药业有限公司提供，含量为98.5%。药敏纸片：杭州天和微生物试剂有限公司。菌株：金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC29213，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法 耐诺氟沙星金黄色葡萄球菌人工诱导耐药株的建立：采用人工逐步诱导方法。将金黄色葡萄球菌标准株ATCC29213 100μL于含诺氟沙星浓度为8μg/mL的MH肉汤中置于37℃振荡培养箱中培养18h；取100μL菌液在含药琼脂上涂板，置37℃恒温培养箱中培养18h，观察细菌生长情况，再将细菌接种于含诺氟沙星16μg/mL MH肉汤中培养，以此类推，将金黄色葡萄球菌置于含诺氟沙星浓度32、64、128、256μg/mL的肉汤中依次诱导。测定各菌株的MIC，并经过5次无药平皿上传代证实为非适应性生长后保存备用。

中药处理株的建立：将人工诱导建立的各种耐药金黄色葡萄球菌菌液稀释到1×108CFU/mL，取100μL加入含有抑菌浓度复方黄连制剂的MH肉汤培养基中37℃振荡培养3代，即得中药处理株。

试验分组：试验分为敏感标准株组、耐药株组和中药处理株组3组。

引物的设计与合成：根据GenBank中金黄色葡萄球菌DNA旋转酶gyrA基因序列，采用Primer5软件设计gyrA基因引物，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游（forward）引物为：P1 5′－CATTGCCAGATGTTCGTGATGG－3（22bp）；下游（reverse）引物为：P2 5′－ACCACGACCTGTTTCA TATGCA－3（22bp）。

PCR反应体系：为50μL体系：dNTP：4μL；10×PCR Buffer（含 Mg2＋）5μL；Taqplus酶1μL；gyrA F 1μL；gyrA R 1μL；超纯水37μL；总DNA1μL。

PCR反应条件：95℃热启动5min后加Taqplus DNA聚合酶；94℃ 变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；最后72℃温育7min。

琼脂糖凝胶电泳［3］：1.0%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）电泳，电压恒定为150V，30min，以DNA Marker（DL－2 000）为标准分子量。电泳结束后，取胶在凝胶成像系统拍照记录结果。

PCR产物的回收与测序及序列分析 用DNA回收试剂盒回收PCR产物，纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，用DNAsis软件分析测序结果。

2 结果

2.1 gyrA基因PCR产物电泳结果 人工诱导的SAR－1、SAR－2和SAR－3耐药突变株和经复方黄连制剂处理的3株耐药突变株gyrA的基因序列在596bp处扩增出了DNA旋转酶亚单位A基因（gyrA）目的条带，结果见图1。

图1 gyrA基因PCR产物部分电泳图谱

2.2 金黄色葡萄球菌标准株、耐药突变株及复方黄连制剂处理的耐药突变株gyrA基因突变分析结果 标准株、突变株及复方黄连制剂处理的耐药突变株gyrA基因所测序列用DNAsis软件分析结果见表1。结果表明，与金黄色葡萄球菌敏感标准菌（ATCC29213）的gyrA基因序列相比，突变株SAR－1、SAR－2和SAR－3gyrA 基因序列均发生了125位碱基C→ T突变；SAR－3还发生了251位碱基C→T、295位碱基A→G突变。经复方黄连制剂处理后的突变株SAR－1和SAR－2gyrA基因碱基无回复突变；但SAR－3发了251位碱基T→C、295位碱基G→A的回复突变，即回复到与标准株相同。

2.3 金黄色葡萄球菌标准株、耐药突变株及复方黄连制剂处理的耐药突变株gyrA基因氨基酸序列分析结果 由DNAsis软件分析，与金黄色葡萄球菌敏感标准菌（ATCC29213）的gyrA基因氨基酸序列比较，突变株SAR－1、SAR－2和SAR－3gyrA 基因的氨基酸序列均发生42位丝氨酸（Ser）→苯丙氨酸（Phe）突变；SAR－3还发生了84位丝氨酸（Ser）→缬氨酸（Val）和99位赖氨酸（Lys）→谷氨酸（Glu）。SAR－1和SAR－2经复方黄连制剂处理后，氨基酸序列没有发生回复突变；但SAR－3发生了84位缬氨酸（Val）→丝氨酸（Ser）和99位谷氨酸（Glu）→赖氨酸（Lys）的回复突变。

3 讨论

3.1 gyrA基因序列突变与细菌耐药性的关系 本试验建立的对诺氟沙星 MIC值为64μg/mL、128 μg/mL和256μg/mL的耐药突变株gyrA基因序列均发生了125位碱基C→T的突变，MIC为256 μg/mL的耐药株，除以上突变点外，还发生了251位碱基C→T、295位碱基A→G突变。这表明细菌的耐药性程度越高，碱基突变率增加。由此可见，细菌以DNA旋转酶为基础而形成的耐药性是逐步积累发展起来的，要获得高水平的耐药，需多位点的突变，需要更高的MIC。

3.2 gyrA基因氨基酸突变与细菌耐药性的关系杜悦等［4］探讨金黄色葡萄球菌的氟喹诺酮耐药性与gyrA、gyrB基因突变的关系，结果表明，金黄色葡萄球菌的氟喹诺酮耐药性与gyrA的丝氨酸（Ser）85→亮氨酸（Leu）和丝氨酸（Ser）84→脯氨酸（Pro）突变密切相关，结论是：gyrA突变是金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮耐药水平增高的主要原因。闭兴明等［3］探讨了金黄色葡萄球菌菌gyrA、gyrB、grlA、grlB和norA基因突变与环丙沙里耐药性的关系，结果表明：gyrA中的2个突变（位于84和88密码子）与环丙沙星耐药性明显相关，gyrA中多个点突变的结合往往较单一点突变菌株表现有更高的环丙沙星的 MIC。据资料报道［5－7］：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、流感杆菌、淋球菌、痢疾杆菌、沙门菌等gyrA 83位均为丝氨酸，耐药突变后多被疏水性氨基酸，如亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨所替代，导致该位点因亲水性降低而产生耐药。本试验结果也发生了类似的突变：84位亲水性丝氨酸被疏水性缬氨酸取代。我们发现84位和99位氨基酸突变与高浓度耐药有关。此外，有关gyrA基因上新的突变位点已有报道［8］，不同细菌，不同药物诱导及细菌的不同生长期，可能都会导致其突变位点的改变。

表1 标准株、耐药突变株和中药处理株gyrA基因碱基与氨基酸序列突变分析

3.3 复方黄连制剂对gyrA基因的回复突变作用经复方黄连制剂处理的高水平、多位点耐药菌gyrA基因序列和氨基酸序列可发生部分回复突变作用，因此使耐药突变株对诺氟沙星敏感性又大大提高。试验结果表明，84位和99位氨基酸突变与细菌的高水平耐药性有密切的关系。复方黄连制剂对84位和99位氨基酸具有回复突变的作用，因此具有耐药抑制作用。但为何对其他突变碱基没有回复突变，有关机理还有待进一步的研究。

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