野鸢尾总黄酮的提取*

齐建红，赵咏梅，方刚，李丹，王改改

(西安文理学院生物技术学院，陕西西安，710065)

野鸢尾(Iris dichotoma)为鸢尾科鸢尾属植物，又名白射干、射干鸢尾，根茎或全草入药，具有清热解毒、止痛等功效。广泛分布于黑龙江、吉林、内蒙古、陕西等地，生于沙质草地、山坡、丘陵等处［1］。常用于咽喉肿痛、胃痛、肝炎、乳腺炎、牙龈肿痛等治疗［2］。迄今为止，从野鸢尾中已经分离得到了30多个化合物［3］，主要为黄酮类化合物［4］。黄酮类化合物广泛存在于植物中，它的生理活性较为广泛，具有抗氧化抗衰老、抗菌抗病毒、免疫调节、治疗脑血管病及降血脂等功能［5］。本文对野鸢尾中主要的活性成分——总黄酮的提取工艺进行了研究，以便更好地开发和利用野鸢尾。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野鸢尾(采自陕西秦岭红河谷，经张九东老师鉴定为野鸢尾)，芦丁对照品(中国食品药品检定研究院)，硝酸铝，亚硝酸钠，无水乙醇等均为分析纯。

UV－2450紫外分光光度计(日本岛津公司)，JY92－2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，FZ102型微型植物试样粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)，万分之一天平(德国赛多利斯)。

1.2 实验方法

1.2.1 检测波长的选择

精密量取0.15 mg/mL芦丁标准溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入体积分数60%的乙醇5 mL，再加入质量分数5%NaNO20.3 mL，摇匀，放置6 min;再加入质量分数为10%的Al(NO3)30.3 mL，摇匀，放置6 min;最后加入1 mol/L NaOH溶液2 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min，以空白试剂做对照，用紫外分光光度计在波长450～550的范围内进行扫描，确定最大吸收波长。

1.2.2 供试品溶液的制备

精密称取野鸢尾粉末1.0 g于烧杯中。加入一定量60%的乙醇在一定温度下200 W超声一定时间趁热减压抽滤得上清液即可。

1.2.3 对照品溶液的制备与标准曲线的绘制［6］

精密称取芦丁标准品15 mg，于小烧杯中，用60%乙醇溶液溶解并转移至100 mL棕色容量瓶中定容，摇匀，即得0.15 mg/mL的芦丁标准溶液。精密量取芦丁标准液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00 mL分别置于10 mL容量瓶中;加入60%乙醇至5 mL;加入5%NaNO20.3 mL，摇匀，放置6 min;再加入10%硝酸铝0.3 mL，摇匀，放置6 min。最后加入1 mol/LNaOH溶液2 mL。用蒸馏水定容至刻度线，摇匀，放置15 min后在波长510 nm处测定吸光度，，以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4 正交试验设计

根据单因素试验结果，确定以乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、料液比(D)4个试验因素进行正交设计，每因素3个水平(表1)，按照L9(34)正交表进行试验，优化野鸢尾总黄酮的提取工艺。

1.2.5 样品分析

对正交试验溶液按1.2.3项下方法进行显色，紫外分光光度计测定吸光度，计算样品中总黄酮得率。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

从图1可以看出，芦丁在波长450～504 nm时吸光度不断增大，当波长超过504 nm之后，吸光度呈下降趋势，因此确定测定波长为504 nm。

图1 检测波长的扫描Fig.1 The scanning figure of detecting wavelength

2.2 芦丁标准曲线的绘制

通过测定不同浓度的芦丁对照品溶液吸光度值，以浓度(mg/mL)对吸光度值进行回归分析，得回归方程为Y=12.674X+0.0044，R2=0.999 4。结果表明芦丁含量在0.0～0.75 mg/mL与吸光度呈现良好的线性关系，如图2所示。

图2 方法-标准曲线Fig.2 Methed－standard curves

2.3 方法学考察［7］

2.3.1 精密度试验

精密吸取芦丁对照品溶液3.00 mL于10 mL容量瓶中，加60% 乙醇5 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min;再加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min;加入1 mol/L NaOH溶液2 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以不加芦丁对照品为空白，在504 nm处测定吸光度，连续6次，平均吸光度为0.582，计算得RSD为1.04%，精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

精密吸取1份野鸢尾供试品溶液3 mL，按照1.2.3 项中的方法显色，分别于间隔0、10、20、30、40、50、60 min，在504 nm波长处测定吸光度。结果显示，1 h内吸光度值无明显变化，计算得RSD 1.22%，供试品溶液显色后在1 h内稳定。所得总黄酮稳定性好，适宜于生产应用。

2.3.3 重复性试验

按照野鸢尾供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液(相同药材重量)，然后分别按照1.2.3项中的方法显色进行测定，计算野鸢尾总黄酮得率，RSD 1.42%，此方法重复性良好。

2.4 正交试验优选总黄酮提取工艺

从表2数据分析可知，乙醇浓度、提取时间、提取温度、固液比4个因素对野鸢尾总黄酮提取的影响主次顺序为:提取温度＞乙醇浓度＞料液比＞提取时间。实验的最优因素水平组合为A2B2C3D1，即，乙醇浓度为80%，提取时间为5 min，提取温度为90℃，料液比1∶20。野鸢尾总黄酮的得率为4.007 mg/g。

表2 L9(34)正交试验设计结果Table 2 Results of L9(34)orthogonal test

2.5 实验因素对总黄酮提取量影响的方差分析

从方差分析结果(见表3)可知，乙醇浓度和提取温度2个因素对总黄酮提取率都有显著影响，液料比和提取时间的影响不显著。提取温度对总黄酮提取率影响最大，乙醇浓度对总黄酮提取率影响较大，其次，料液比对总黄酮的提取有一定影响，4个因素中，以提取时间影响最小。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis for the orthogonal array design experimental results

3 结论

野鸢尾可以作为观赏植物，又具有一定的药用价值，本实验首次对野鸢尾总黄酮进行了提取工艺优化研究，结果表明，影响野鸢尾总黄酮的最佳提取工艺因素为提取温度＞乙醇浓度＞料液比＞提取时间，最佳提取工艺条件为A2B2C3D1。即乙醇体积分数为80%，料液比1∶20(g∶mL)，提取时间为 5 min，提取温度为90℃，此条件下总黄酮为4.007 mg/g。为野鸢尾中黄酮成分在食品药品领域的开发利用研究提供了科学的理论依据。

［1］赵毓棠.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1985，16(1):134.

［2］王冰，徐岩，郑太坤，等.射干鸢尾的核型分析［J］.中国药学杂志，1998，33(12):716－719.

［3］齐建红，翟永功，赵长琦.鸢尾属植物的化学成分及其生物活性［J］.天然产物研究与开发，2006，18(1):165－170.

［4］齐建红.野鸢尾植物的生物学特征及化学成分研究进展［J］.陕西农业科学，2013，(2):121－123.

［5］曹纬国，刘志勤，邵云，等.黄酮类化合物药理作用的研究进展［J］.西北植物学报2003，23(12):2241－2247.

［6］扶庆权，徐鉴.正交试验法优化草莓中总黄酮的提取工艺研究［J］.中国食品添加剂，2011(6):130－135.

［7］陶阿丽，戴一，华芳.桂花中总黄酮提取工艺及采收期研究［J］.食品与发酵工业，2013，39(2):247－249.