双花千里光总黄酮的提取工艺优化及其抗氧化活性*

韩贺东，胡海清，林燕，陈练红，王晓玲

(西南民族大学少数民族药物研究所，四川 成都，610041)

藏药双花千里光(Senecio dianthusFranch. )主要分布于我国西藏、四川和云南［1］，具有祛风除湿、清热解毒等特效［2－3］。《藏药志》记载其主要用于治疗伤口发炎、肿胀、急性结膜炎、皮炎、跌打损伤等症［4］。千里光属植物种类繁多，其主要成分有吡咯里西定类生物碱(pyrrolizidine alkaloids，PAs)及呋喃雅槛蓝型倍半萜(furoeromophilanes)，另外还含有黄酮及挥发油［5－7］。本实验以总黄酮含量为指标，采用正交实验优选双花千里光提取工艺。人体内的羟自由基是一种氧化能力很强的活性氧分子，对人的机体危害很大［8］，本实验对双花千里光总黄酮粗提物的抗氧化活性进行了初步研究，发现其具有良好的清除羟基自由基能力。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

SHB－3 循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司;UV－1901 紫外分光光度计，北京普析通用仪器公司;AE 240 电子天平，瑞士Metter Toledo 公司;W201 恒温水浴锅，上海申生科技有限公司;GHG－9240A 型 电热恒温鼓风干燥箱，上海精密实验设备有限公司。

1.2 试药

藏药双花千里光采自西藏拉萨，经西南民族大学刘园教授鉴定为菊科千里光族(Senecioncea)千里光属植物双花千里光(Senecio dianthusFranch. )。芦丁由本实验室制备，其结构经质谱、紫外、红外、核磁共振谱等波谱进行表征，纯度大于99.5 %，其余试剂均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 总黄酮含量的测定

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品12.0 mg，置于50 mL 容量瓶中，加体积分数为70%的乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液备用。

2.1.2 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置于25 mL 量瓶中，分别加质量分数为5%的NaNO21 mL，摇匀，静置6 min，再加质量分数10%的Al(NO3)31 mL，摇匀，静置6 min，再加质量分数5% NaOH 试液10 mL，用体积分数70% 乙醇稀释至刻度，摇匀，静置15 min 后，以提取液作为参比溶液，按照紫外-可见分光光度法(中国药典2005 年版一部附录V A)，在510 nm 波长处测定吸光度。以吸光度对溶液浓度进行回归分析，结果浓度在0.0190 ～0.0480 mg/mL 内呈良好线性关系。回归方程为Y=10.564X+0.0052，R2=0.999 1。

2.1.3 总黄酮含量的测定

取提取液1 mL，按2.1.2 方法显色、测定，计算总黄酮含量，空白组为不加显色剂的提取液，其余操作相同。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验结果及正交实验

3.1.1 不同提取温度对双花千里光总黄酮含量的影响

准确称取1 g 干燥双花千里光粗粉，加入体积分数70%乙醇20 mL，不同温度下提取1.5 h，提取1次。抽滤，用少量提取溶液洗涤，滤液定容至100 mL容量瓶中，取0.5 mL 于25 mL 容量瓶，按2.1.2 方法显色，定容，测定总黄酮含量。不同温度对双花千里光总黄酮含量的影响如图1 所示。50 ～80 ℃总黄酮含量随温度上升而增加，温度超过80 ℃总黄酮含量呈下降趋势，可能是由于温度太高而造成黄酮氧化分解［11］。因此，确定适宜提取温度为80 ℃。

图1 提取温度对双花千里光总黄酮含量的影响Fig.1 Influence of temperature on the yield of total flavonoids in Senecio dianthus Franch

3.1.2 提取时间对双花千里光总黄酮含量的影响

准确称取1 g 干燥双花千里光粗粉，加入70%乙醇20 mL，80 ℃分别下提取0.5，1，1.5，2，2.5 h，提取1 次。抽滤，用少量提取溶液洗涤，滤液定容至100 mL 容量瓶中，取0.5 mL 于25 mL 容量瓶，按2.1.2方法显色，定容，测定总黄酮含量。不同提取时间对双花千里光总黄酮含量的影响如图2 所示。0.5 ～2 h 总黄酮含量随提取时间上升而明显增加，2 h 之后呈下降趋势，可能是由于提取时间过长导致黄酮分解［12］。因此，确定适宜提取时间为2 h。

图2 提取时间对双花千里光总黄酮含量的影响Fig.2 Influence of extraction time on the yield of total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

3.1.3 乙醇浓度对双花千里光总黄酮含量的影响

准确称取1 g 干燥双花千里光粗粉，加入不同体积分数的乙醇20 mL，80 ℃下提取1.5 h，提取1 次。抽滤，用少量提取溶液洗涤，滤液定容至100 mL 容量瓶中，取0.5 mL 于25 mL 容量瓶，按2.1.2 方法显色，定容，测定总黄酮含量。不同乙醇浓度对双花千里光总黄酮含量的影响如图3 所示。随着乙醇体积分数的增加，总黄酮含量先增长后减少，因此，确定适宜的乙醇体积分数为60%。

图3 乙醇浓度对双花千里光总黄酮含量的影响Fig.3 Influence of ethanol concentration on the yield of total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

3.1.4 液固比对双花千里光总黄酮含量的影响

准确称取1 g 干燥双花千里光粗粉，加入不同体积的70%乙醇，80 ℃下提取1.5 h，提取1 次。抽滤，用少量提取溶液洗涤，滤液定容至100 mL 容量瓶中，取0.5 mL 于25 mL 容量瓶，按2.1.2 方法显色，定容，测定总黄酮含量。不同液固比对双花千里光总黄酮含量的影响如图4 所示。随着液固比的增加，总黄酮含量逐渐升高，当液固比超过25:1 后，总黄酮含量几乎不再增加。因此，确定适宜的液固比为25 ∶1(mL∶g)。

图4 液固比对双花千里光总黄酮含量的影响Fig.4 Influence of material fluid ratio on the yield of total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

3.2 正交实验

根据单因素实验的结果，选取影响双花千里光总黄酮含量的4 个因素:提取温度(A)、提取时间(B)、液固比(C)、乙醇体积分数(D)作为考察因素，因素水平安排见表1。每个因素设定3 个水平，按L9(34)表安排实验，并计算总黄酮含量。实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 双花千里光总黄酮含量正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

表2 双花千里光总黄酮含量正交实验结果Table 2 Results of the orthogonal design for total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

表3 双花千里光总黄酮含量方差分析Table 3 Results of variance analysis for total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

实验结果表明，影响藏药双花千里光总黄酮含量的因素顺序为:提取温度＞乙醇浓度＞液固比＞提取时间。确定最佳提取工艺条件为:A3B2C3D3，即:提取温度为90 ℃，提取时间为2 h，液固比为30:1 mL/g，乙醇浓度为70%。对优选出的工艺条件进行验证，按照优选的工艺条件，重复测定3 次，总黄酮含量平均值为14.27%，RSD 为0.46%。表明该工艺合理可行。

3.3 抗氧化活性的测定结果

3.3.1 双花千里光总黄酮粗提物还原能力

根据Fenton 反应原理及参考文献［13］，在10 mL试管中分别加入不同浓度(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL)的双花千里光总黄酮溶液2.5 mL，再加入2.5 mL 磷酸缓冲溶液(0.2 mol/L，pH =6.6)和2.5 mL 的质量分数1%的铁氰化钾溶液，置于50 ℃反应20 min，快速冷却，取出试管后立即加入2.5 mL的质量分数10%的三氯乙酸溶液，混匀后离心，吸取上清液2.5 mL 于具塞管中，随即加入2 ml 蒸馏水，0.5 mL 的0.1%三氯化铁溶液。摇匀，静置后以水为对照，在700 nm 处测定其吸光度，每个浓度平行做3次，取其平均值。双花千里光总黄酮粗提物的还原能力如图5 所示。随着浓度的增加，总黄酮粗提物和Vc 的还原能力都逐渐增强，但总黄酮粗提物的还原能力要弱于Vc。

图5 双花千里光总黄酮粗提物还原能力测定Fig.5 The reducing capacity of total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

3.3.2 双花千里光总黄酮粗提物对羟自由基( ·OH) 的清除作用

［14－15］，在10 mL 试管中依次加入6 mmol/L 的FeSO4的溶液1 mL，不同浓度(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL)的总黄酮溶液1 mL，6 mmol/L 的H2O2溶液1 mL，摇匀，静置10 min，再加入6 mmol/L 的水杨酸溶液1 mL，摇匀，静置30 min。以水为对照，于510 nm 处测定器吸光值。清除率的计算公式:

清除率/% =［1 －(A1－A2)/A0］×100

式中:A0，用水代替总黄酮溶液测得的吸光度;A1，不同浓度总黄酮溶液的吸光度;A2，用水代替水杨酸时不同浓度的总黄酮下测得的吸光度。

双花千里光总黄酮粗提物对羟自由基(·OH)的清除作用如图6 所示。随着浓度的增加，总黄酮粗提物和Vc 对羟自由基(·OH)的清除能力都逐渐增强，当浓度大于0.03 mg/mL 时，总黄酮粗提物对羟自由基(·OH)的清除能力要强于Vc，清除率均高于65%，具有良好清除羟自由基(·OH)的能力。

图6 双花千里光总黄酮粗提物对羟自由基(·OH)的清除能力Fig.6 The·OH clear capacity of total flavonoids in Senecio dianthus Franch

参 考 文 献

［1］ 中国科学院植物研究所. 中国高等植物科属检索表［M］. 北京:科学出版社1985:445.

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［4］ 中国科学院西北高原生物研究所. 藏药志·植物药类［M］. 西宁:青海人民出版社，1991:323.

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［6］ Botdmann F，Zdero C，Jakupovic J，et al． Further Pyrrolizidine Alkaloids and Furoeremo-philanes from Senecio Species［J］． Phytochemistry，1986，25(5):1 151．

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［8］ 李艳辉，格桑索朗，阿萍，等. 双花千里光花精油化学成分的GC/MS 分析［J］. 分析试验室，2006，25(7):42－45.

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