聚乙二醇沉淀法与凝胶色谱层析法检测巨泌乳素的相关性研究

王 霞， 刘金玲， 高 硕

(1.天津市血液中心，天津300110;2.天津市医科大学总医院，天津300052)

泌乳素(prolactin，PRL)是垂体前叶分泌的一种多肽类激素。PRL的正确检测关系到临床正确诊断、合理治疗和预后的判断。文献报道［1-2］巨泌乳素(macroprolactin，MPRL)的存在是导致高PRL的重要原因之一。MPRL能被某些免疫检测仪误认为PRL报告给临床，给高泌乳素血症(hyperprolactinemia，HPRL)的诊断带来很大干扰。如何排除干扰，提高PRL检测的准确性已成为临床和实验室关注的重点。

目前，凝胶色谱层析(gel filtration chromatograpy，GFC)法被公认为检测MPRL的金标准［3］，但因检测技术较复杂，检测时间长且费用昂贵而不适合临床常规筛查。相比较而言，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀法经济、简便、易行。我们对PEG沉淀法与GFC法进行比较，初步探讨PEG沉淀法检测MPRL的可行性。

材料和方法

一、标本来源

选自2009年1月至2010年1月就诊于天津医科大学总医院妇产科及内分泌科的HPRL患者26例，均为女性，年龄18～46岁。所有标本经Bayer ACS180化学发光免疫分析仪测定血清PRL后，留取血清－70℃保存待检，同时搜集该病例的临床诊断及影像学资料，根据临床诊断、影像学资料及实验室检测分为真性HPRL组(简称真泌组)11例及MPRL血症组(简称巨泌组)15例。

二、GFC法分离血清PRL

1.凝胶色谱柱 规格1.6 cm×80 cm凝胶色谱柱购自天津嘉悦玻璃制品有限公司。

2.填充介质 Sephadex G100购自美国法玛西亚生物有限公司。

3.组分定标 兰葡聚糖(相对分子质量2.5×103)，乙醇脱氢酶(相对分子质量150×103)，牛血清白蛋白(相对分子质量66×103)，碳酸酐酶(相对分子质量29×103)，以上标准品均购自美国Sigma-aldrich公司。根据定标体积收集目标组分。

4.洗脱缓冲溶液配制 10 mmol/L Tris缓冲液(pH 值 7.4)，含 10 mmol/L Tris、140 mmol/L NaCl、1.25 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2及0.02%NaN3。使用前用0.4 μm 滤膜抽滤，4 ℃保存待用。

5.仪器 BS-100A型自动部分收集器及自动恒流泵均购自上海沪西分析仪器有限公司。UV-2501型紫外分光光度检测仪购自日本岛津公司。

6.标本预处理 血清自－70℃取出融化后平衡至室温，混匀后2 000×g离心10 min，取血清中段，用0.2μm滤膜过滤，吸取血清待用。

7.GFC法上机分离参数 流速0.5 mL/min，上样量1.0 mL。洗脱相为10 mmol/L Tris缓冲液(pH 值7.4)。

8.收集组分 每收集1.5 mL为一管，每份标本收集100管，经Bayer ACS180化学发光免疫分析仪检测PRL浓度。将检测结果录入EXCEL表格并绘制PRL层析图。

三、PRL及MPRL检测

1.PRL检测 Bayer ACS180化学发光免疫分析仪及其配套试剂均购自美国拜耳公司，高、中、低值质控品均购自美国伯乐公司。PRL检测灵敏度为0.3 ng/mL，批内变异系数(CV)为2.5%～3.8%，批间 CV为3.6%～4.5%。

2.MPRL筛查 25%PEG(相对分子质量为6 000)购自北京鼎国生物技术有限公司，溶液4℃保存用作 MPRL的沉淀剂。AllegraTMCentrifuge超速冷冻离心机购自美国贝克曼公司。

3.MPRL筛查方法 每份血清取250μL，加等量的25%PEG溶液，充分混匀后室温放置30 min，4℃ 2 000×g离心30 min，取上清液分别检测PRL值。PRL测定回收率=［(PEG沉淀后PRL值×2)/PEG沉淀前PRL值］×100%，回收率≤40%提示该标本含有MPRL［4-6］。

四、统计学分析

采用SPSS11.5软件进行统计处理。因数据呈偏态分布，故采用中位数(P2.5～P97.5)表示。多组数据比较采用Wilcoxon符号秩检验，组间比较采用非参数Kruskal-Wallis H检验，线性回归分析采用Spearman相关系数。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、GFC法分离MPRL与真性HPRL的PRL层析谱

混合标准品分离结果见图1。根据目标PRL相对分子质量大小，依据定标体积收集相应组分。MPRL血症色谱分离结果见图2，HPRL色谱分离结果见图3。

图1 GFC法混合标准品分离结果

图2 GFC法分离MPRL血症各组分PRL

图3 GFC法分离HPRL各组分PRL

二、真泌组与巨泌组PEG处理前、后PRL浓度比较

真泌组与巨泌组血清处理前总PRL浓度差异无统计学意义(P=0.113)，而处理后真泌组明显高于巨泌组(P＜0.05)，结果见表1。

表1 真泌组和巨泌组PEG处理前、后PRL浓度比较 (ng/mL)

三、GFC法与PEG沉淀法检测真泌组与巨泌组单体PRL浓度的比较

采用GFC法与PEG沉淀法检测真泌组和巨泌组单体PRL浓度差异无统计学意义(P＜0.05)，结果见表2。

表2 GFC法与PEG沉淀法检测真泌组与巨泌组单体PRL浓度 (ng/mL)

四、GFC法与PEG沉淀法检测真泌组与巨泌组单体PRL回收率比较

GFC法与PEG沉淀法检测真泌组与巨泌组单体PRL回收率差异无统计学意义(P＞0.05)，结果见表3。

表3 GFC法与PEG沉淀法检测真泌组与巨泌组单体PRL回收率 (%)

五、GFC法与PEG沉淀法检测26例HPRL血清单体PRL的相关性比较

PEG沉淀法与GFC法的相关性良好［相关系数(r)=0.844，P=0.000］，见图4。

图4 GFC法与PEG沉淀法检测单体PRL的相关性比较

讨 论

垂体前叶嗜酸性细胞合成的PRL含有199个氨基酸，其中包括6个半胱氨酸。经GFC法确认，主要存在3种不同相对分子质量的PRL，即有活性的23×103的单体PRL、无或低生物活性而有免疫反应性的(45～60)×103的大PRL及＞100×103的 MPRL。正常人血清中单体 PRL约占85%～95%，MPRL 仅约占1%［7］。

GFC法作为MPRL血症经典的确证试验，最大的优点是能很好的区分MPRL、大PRL及单体PRL，直接证明血清中MPRL的存在，并能通过色谱洗脱曲线峰下面积计算PRL各种分子形式的比例和含量。

本研究中真性HPRL患者与MPRL患者血清总PRL浓度在PEG处理前差异无统计学意义(P=0.113)，表明MPRL血症与真性HPRL在生化指标上很难区分，而PEG处理后真泌组明显高于巨泌组(P＜0.05)，提示MPRL具有免疫反应性，对某些检测系统免疫检测造成干扰［8］。本研究利用GFC法证实的MPRL血症与真性HPRL患者单体PRL比例不同，真性HPRL中单体PRL占46.12%～81.73%，MPRL血症中单体 PRL仅占7.43%～35.95%，二者比较有明显差异(P=0.000)。

本研究表明PEG沉淀法与GFC法具有良好的相关性(r=0.844，P=0.000)，与Lucille 等［3］报道的研究结果相一致(r=0.80)，且本研究结果也表明PEG沉淀法具有良好的稳定性。

Quinn等［9］报道在PRL增高患者中有25%存在MPRL，真性HPRL和MPRL血症不能仅仅根据临床表现区分。因此，正确诊断HPRL，避免不必要的检查和不恰当的治疗、随访，对PRL增高的患者进行筛查是有必要的。尽管GFC法是检测MPRL的金标准［10］，但由于技术复杂、检测时间长、费用昂贵，限制了其在实验室中的常规使用。本研究对PEG沉淀法与GFC法进行方法学比较，初步结果表明PEG法与GFC法具有良好的相关性，且简便、易行。可考虑作为实验室MPRL血症的常规筛查方法。

［1］方 军，潘恩云.高泌乳素血症患者筛查巨泌乳素的临床意义［J］.检验医学，2011，26(10):686-688.

［2］姜跃伟，奚经巧，朱诗呈，等.用聚乙二醇沉淀法筛查高泌乳血症的应用评价［J］.检验医学，2009，24(4):268-270.

［3］Kavanagh L，McKenna TJ，Fahie-Wilson MN，etal.Specificity and clinical utility of methods for the detection of macroprolactin［J］.Clin Chem，2006，52(7):1366-1372.

［4］Fahie-Wilson M，Brunsden P，Surrey J，etal.Macroprolactin and the Roche Elecsys prolactin assay:characteristics of the reaction and detection by precipitation with polyethylene glycol［J］.Clin Chem，2000，46(12):1993-1995.

［5］Leslie H，Courtney CH，Bell PM，etal.Laboratory and clinical experience in 55 patients with macroprolactinemia identified by a simple polyethylene glycol precipetation method［J］.J Clin Endocrinol Metab，2001，86(6):2743-2746.

［6］Fahie-Wilson MN，Soule SG.Macroprolactin aemia:contribution to hyperprolactinaemia in a district general hospital and evaluation of a screening test based on precipitation with polyethylene glycol［J］.Ann Clin Biochem ，1997，34(Pt 3):252-258.

［7］Sadideen H，Swaminathan R.Macroprolactin:What is it and what is its importance［J］.Int J Clin Pract，2006，60(4):457-461.

［8］Gibney J，Smith TP，McKenna J.Clinical relevance of macroprolactin［J］.Clin Endocrinol(Oxf)，2005，62(6):633-643.

［9］Quinn AM，Rubinas TC，Garbincius CJ，etal.Determination of ultrafilterable prolactin:elimination of macroprolactin interference with a monomeric prolactin-selective sample pretreatment［J］.Arch Pathol Lab Med，2006，130(12):1807-1812.

［10］王 霞，刘金玲，高 硕.高泌乳素血症中巨泌乳素检测的研究进展［J］.国际检验医学杂志，2010，31(3):263-264.