高压液相色谱检测糖尿病患者尿白蛋白的应用

史 梅， 史伟峰， 李燕梅

(常州市第一人民医院检验科，江苏常州213003)

近年来，尿白蛋白应用日趋广泛［1］，正逐渐成为尿液蛋白化学的重要检测项目。除作为传统意义上的肾脏损伤的诊断及检测指标外，也被用于糖尿病［2］并发症、心血管疾病危险因子的早期诊断和监测等。尿白蛋白检测的名称曾一度被称为尿微量白蛋白检测。近来国际相关专家提议规范的名称应采用尿白蛋白检测［3］。近期发现糖尿病(可能也包括心血管病、高血压)患者尿中的一部分白蛋白用常规的免疫化学检测手段不能检出，且在尿中出现得比较早，这种蛋白暂且被命名为免疫化学非反应性白蛋白(immunochemically nonreactive urinary albumin，INUA)。INUA 目前已引起极大关注。为了准确检测尿白蛋白，提早检出异常尿白蛋白，我们改进尿白蛋白的检测方法，尝试用高效液相色谱法(HPLC)检测尿总白蛋白，将其与临床常规免疫方法进行比较，并初步应用于临床样本的检测。

材料和方法

一、对象

选择常州市第一人民医院内分泌科患者糖尿病(DM)患者85例，男40例，女45例，年龄20～88岁，收集24h尿液。正常对照组40名，男19名，女21名，年龄21～82岁，为常州市第一人民医院健康体检人群，排除DM、肾脏疾病、高血压、心血管、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病，年龄、性别组成与DM组匹配。样本收集后冻存于－70℃待检。

二、方法

每例样本分别采用HPLC和免疫比浊法测定尿白蛋白。

HPLC参照文献［4］进行检测。Agilent 1200色谱仪，Agilent Zorbax oligo 80 mm×6.2 mm、5μm column色谱柱，流动相为乙腈∶H2O=93∶7，0.1%TFA，柱温40 ℃，检测波长210 nm，流速0.5 mL/min，进样量 10 μL，白蛋白标准品(sigma公司，产品号p0914)。

免疫比浊法(免疫散射比浊法)采用BECKMAN-COULTER IMMAGE 800免疫比浊仪及配套试剂(贝克曼库尔特公司)。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0软件对结果进行统计学分析。计量资料符合正态分布的以±s表示，偏态分布的资料以中位数(范围)表示。非正态分布的2组之间比较采用Mann-Whitney U检验。2种方法间结果的比较用直线回归和Bland-Altman进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、HPLC检测结果

白蛋白标准品含量分别为500、200、100、50及0 mg/L。以标准品含量为横坐标，与含量相对应的峰面积为纵坐标作图，两者呈良好线性关系，用最小二乘法得出回归方程为Y=2.948 2X+38.601，r2=0.994 4。见图1。标准品和样本的保留时间(RT)均为2.42 min。见图2。

尿白蛋白浓度为40.1和152.6 mg/L的样本其批内和批间CV分别为4.1%、4.8%和5.6%、6.5%。最低检测限为2 mg/L。

图1 HPLC测定白蛋白标准品的线性

图2 HPLC测定尿白蛋白的色谱图

二、HPLC和免疫比浊法测定尿蛋白的结果比较

85例糖尿病患者的尿液样本用HPLC和免疫比浊法测定的白蛋白浓度分别为21.0(3.4～678.9)mg/L和 8.2(2.0～442.2)mg/L，二者比较差异有统计学意义(P＜0.01);HPLC测出的结果普遍偏高，但偏高的倍数不一致，最小为1.3倍，最大为6.1倍。正常对照组HPLC法和免疫比浊法测定的白蛋白浓度分别为6.8(2.8～12.4)mg/L和 5.2(2.0～10.1)mg/L，差异无统计学意义(P＞0.05)。

将2种方法的测定结果进行回归分析，以免疫比浊法测定结果为X，HPLC测定结果为Y，回归分析结果见图3，方程为Y=17.58+1.703X，r2=0.79。2种方法的相关性和一致性较差。

将2种方法进行Bland-Altman一致性分析，以2种方法测定值的均值为横坐标，HPLC与免疫比浊法的差值为纵坐标，散点图见图4。有4个点(4.7%，4/85)落在偏倚均值±2s范围外，界限内的最大差值(184.7 mg/L)相对于2种方法的均值(51.7 mg/L)来说偏倚已相当大，临床上不能接受，2种方法一致性较差。

以尿白蛋白排泄率(AER)＞30 mg/24h为诊断微量蛋白尿的标准，HPLC和免疫比浊法检出的阳性例数分别为48例(56.5%)和27例(31.8%)。有21例(24.7%)DM 患者的尿样本用HPLC检测出微量蛋白尿，而常规免疫比浊法未测出。

图3 免疫比浊法和HPLC尿白蛋白测定结果的直线回归分析

图4 HPLC和免疫比浊法结果进行Bland-Altman分析

讨 论

尿白蛋白检测项目临床应用极为广泛，对多种疾病引起的肾脏损伤具有重要预测价值。尿白蛋白的定量方法从化学法进步到免疫法，以至HPLC、质谱法以及尿液蛋白质组学等，但仍存在很多问题而影响测定的准确性以及测定结果的一致性和互通性。我国目前尚无统一的指南规范尿白蛋白的检测及报告要求，尿白蛋白检测及报告中存在着诸多问题，影响其更好的临床应用。2001年Greive等［5］发现患DM鼠的尿中白蛋白含量增高，但用常规的免疫化学法无法检测到。Comper等［6］用HPLC来测定糖尿病患者尿中的白蛋白，证实了尿中存在着用免疫化学法不能测定的白蛋白，目前暂时被命名为INUA。

本研究结果显示DM患者尿白蛋白的HPLC检测结果普遍高于免疫比浊法，但偏高的倍数不一致，最小为1.3倍，最大为6.1倍，并不是相同的系统偏差。将2种方法用回归和Bland-Altman进行一致性分析，也证明2种方法的一致性较差。正常对照组HPLC和免疫比浊法的测定值差异无统计学意义(P＞0.05)。本研究所用的Sigma公司白蛋白标准品和免疫散射比浊法尿微量白蛋白标准品可溯源至同一白蛋白国际参考物;这个结果类似于Comper等［6］的实验结果，说明2种方法结果的差异并非两者标准品不同所致，而是由于不同患者尿液中INUA和免疫化学反应性白蛋白两者的比例不同。HPLC和免疫比浊法检测中达到诊断微量蛋白尿的例数分别为48例和27例，检出率分别为56.5%和31.8%，HPLC的阳性检测率明显高于免疫比浊法，其中21例用HPLC检测已经达到微量蛋白尿诊断标准，而用免疫比浊法检测为阴性。这是因为免疫比浊法的原理是抗原抗体反应，常用的免疫化学原理的分析方法只能检测出那些具有免疫原性的完整白蛋白及一些相对分子质量＞12 000的白蛋白片段和多聚白蛋白凝聚物。而尿液中的白蛋白性质极为复杂，在其经肾脏滤过时，受溶酶体酶的化学修饰作用，可产生＜1%的完整白蛋白及＞99%的白蛋白源性片段(相对分子质量＜10 000)。INUA是白蛋白经过肾小管细胞溶酶体酶处理后的改变形式，虽然其分子仍由17个二硫键连成一体，是完整的白蛋白分子，但已受到了损伤，其分子构型发生了改变，免疫检测方法的抗体不能与之结合，因而不能被检出。由于其相对分子质量仍为66 500，并没有发生改变，因此HPLC同样能检出。DM的早期肾损伤主要是肾溶酶体降解白蛋白和其他蛋白的功能减低。随着肾小球损伤的加重而滤膜的孔径加大，滤过更多的蛋白，溶酶体降级功能不良更加明显，导致更多完整但受损的白蛋白分子出现在尿中，其分子构型有了改变。还有研究认为DM患者血中经常升高的葡萄糖和脂肪酸也会引起白蛋白构型的改变。因此，DM及一些肾脏病早期的白蛋白尿采用目前的免疫检测方法难以得到准确反映，也存在着较高的漏诊率。

HPLC具有检测灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量准确性好的优点，虽然与临床常用的免疫学方法相比操作比较复杂，但HPLC能检出包括免疫化学反应性和免疫化学非反应性的总的白蛋白，能更准确地反映尿液中的白蛋白含量，可以提高糖尿病肾病(DN)患者中微量白蛋白的检出率，以利于DN的早期发现和早期治疗。有资料表明，HPLC法检测尿白蛋白可以提前预测DM发生血管病变的风险［7］。在目前尚无简便可行的方法能测出尿总白蛋白的情况下，HPLC检测尿白蛋白具有一定的临床意义，但还需要大规模的临床研究。

［1］Ruggenenti P，Remuzzi G.Time to abandon micro albuminuria［J］.Kidney Int，2006，70(7):1214-1222.

［2］KDOQI.KDOQI clinical practice guidelines and clinical practice recommendations for diabetes and chronic kidney disease［J］.Am J Kidney Dis，2007，49(2 Suppl 2):S12-S154.

［3］Miller WG，Bruns DE，Hortin GL，etal.Current issues in measurement and reporting of urinary albumin excretion［J］.Clin Chem，2009，55(1):24-38.

［4］Osicka TM，Comper WD.Characterization of immunochemically nonreactive urinary albumin［J］.Clin Chem，2004，50(12):2286-2291.

［5］Greive KA，Eppel GA，Reeve S，etal.Immunounreactive albumin excretion increases in streptozotocin diabetic rats［J］.Am J Kidney Dis，2001，38(1):144-152.

［6］Comper WD，Osicka TM，Jerums G.High prevalence of immuno-unreactive intact albumin in urine of diabetic patients［J］.Am JKidney Dis，2003，41(2):336-342.

［7］Gunasekara D，Byrnes L，Brown S，etal.Clinical implications of the early detection of urinary microalbumin in diabetic patients using a new high performance liquid chromatography(HPLC)method［J］.Diabetes Res Clin Pract，2011，93(2):e61-e64.