巨泌乳素与假性高泌乳素血症实验室诊断路径研究进展

罗 薇,程歆琦,夏良裕

(中国医学科学院北京协和医院 检验科,北京100730)

泌乳素(prolactin,PRL)是一种肽类激素,在调节女性乳房发育和泌乳中具有重要作用,同时还有渗透调节、血管生成和免疫调节等功能[1]。泌乳素的生理性增高主要见于运动、妊娠、产后及应激状态等;病理性升高时主要临床表现为溢乳、闭经和不育,见于垂体肿瘤、乳腺肿瘤、库欣综合征、肢端肥大症、下丘脑肿瘤等。泌乳素检测是诊断高泌乳素血症的依据,临床实验室常用免疫法测定泌乳素,但是该方法常受巨泌乳素的干扰[2]而出现假性高泌乳素血症,可能导致误诊误治。因此,实验室有必要建立巨泌乳素血症鉴别诊断的方法与路径,识别假性高泌乳素血症,降低临床误诊风险。本文综述巨泌乳素对泌乳素测定的干扰以及其实验室诊断研究进展,以期对实验室建立巨泌乳素血症诊断路径提供帮助。

1 巨泌乳素血症

1.1 巨泌乳素血症的定义与发生率

泌乳素根据其结构和分子量主要分为3种类型,即单体泌乳素、大泌乳素、巨泌乳素(macroprolactin,M-PRL)。泌乳素由于遗传易感性或翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、脱酰胺基化),导致其产生新的表位,分泌到血液后触发了自身抗体IgG的产生,IgG与单体泌乳素丝氨酸残基端结合生成巨泌乳素[3],分子量可达150 kDa甚至更高。正常人体内60%～90%为单体泌乳素,15%～30%为大泌乳素,巨泌乳素含量一般<10%[4]。巨泌乳素血症(macroprolactinemia)是指外周血单体催乳素水平正常,大量泌乳素与IgG结合生成过量的巨泌乳素。如果未被发现,可能会导致误诊和管理不当。研究显示,在一般人群中,巨泌乳素血症的总体患病率在3%～4%之间,但在高泌乳素血症的患者中显著增加,最高可达35%[1]。在英国和美国检测的所有高泌乳素血症病例中有5%～15%可能是由于巨泌乳素血症引起的[5]。巨泌乳素血症在女性中较为常见,但是男性和儿童中也会出现巨泌乳素血症。DONADIO等[6]回顾性研究发现在24名高泌乳素血症男性中有11人(45.8%)存在巨泌乳素血症。

1.2 巨泌乳素血症的临床特点

巨泌乳素血症的出现与许多生理和病理状况有关,包括压力、怀孕、剧烈运动、垂体腺瘤和癌症以及对乳房的机械刺激、胸壁外伤、肝肾疾病、原发性甲状腺功能减退、颅内肿瘤压迫垂体或下丘脑、空蝶鞍综合征、用泌乳素刺激药物等[7]。GIBNEY等[8]回顾了310例巨泌乳素血症患者的临床特征,发现0～45%的患者有溢乳症状,6%～40%的患者有不育症,15%～80%的患者有月经量少或闭经症状。但是并没有直接证据显示这些症状是由巨泌乳素引起的。同时,闭经和溢乳在巨泌乳素血症患者中的发生率(57%和29%)明显低于真正的高泌乳素血症的患者中的发生率(84%和63%)。由于部分巨泌乳素血症患者的症状与高泌乳素血症相似,最初被发现患有高泌乳素血症,但在随访和进一步诊治中发现其排卵或自发受孕,最后确诊是巨泌乳素血症。

因此,巨泌乳素的生物学活性很低,通常无明显临床症状,除非患者自身抗体IgG与泌乳素之间发生间歇性解离,才会由于单体泌乳素的增加而表现出明显的高泌乳素的临床症状。也有部分巨泌乳素血症的患者表现出和高泌乳素血症相一致的临床症状,是由于巨泌乳素血症患者伴有单体泌乳素的增高所导致。美国临床内分泌学家协会和美国内分泌疾病学会推荐,当临床表现、影像学发现和/或对治疗的反应不一致时应考虑巨泌乳素血症的存在[9]。因此,在所有高泌乳素血症的患者中,特别是在缺乏症状的患者中,建议实验室常规筛查巨泌乳素。

2 巨泌乳素对泌乳素检测的干扰

2.1 泌乳素的检测

高泌乳素血症由于其临床表现缺乏特异性,诊断主要依靠实验室对泌乳素含量的测定。目前实验室测定血清泌乳素主要采用免疫学方法,通常采用两点法或夹心法原理。待测泌乳素分别与固相上的捕获抗体和用于检测的标记抗体发生反应,形成捕获抗体-泌乳素-标记抗体复合物。通过洗涤步骤去除未反应的试剂后,标记抗体产生的信号强度与泌乳素的浓度直接相关。该方法可以在很宽的浓度范围内提供快速、精确的结果,并且在外部质量评估方案中显示出很好的方法一致性。尽管大多数泌乳素免疫测定方法已按照世界卫生组织的国际标准进行了标准化,但各个平台检测泌乳素仍存在一定的差异,泌乳素参考范围取决于测定平台且差异很大,可能与检测抗体对泌乳素不同表位的反应性差异有关[10]。

值得注意的是所有免疫测定法都容易受到异嗜性抗体的干扰,制造商通常会添加“封闭剂”以最大程度地减少此类干扰。在目前的泌乳素免疫测定中,虽然异源抗体的干扰非常罕见,但巨泌乳素的干扰很常见,导致高泌乳素血症的误诊,可能引发进一步甚至不适当的治疗。

2.2 巨泌乳素干扰检测的原理

通常情况下巨泌乳素都是单体泌乳素和IgG的复合物,少数情况下,巨泌乳素是被高度糖基化的异常高分子量形式(200～669 kDa),但这类泌乳素特征与常见的泌乳素-IgG复合物形式相似,都具有单体泌乳素的抗原表位,因此巨泌乳素保留了许多商业化免疫测定中使用的抗泌乳素抗体的部分(或全部)免疫反应性,在使用免疫法进行泌乳素测定时,巨泌乳素会与捕获抗体和标记抗体发生反应,产生信号;另外一方面,IgG和单体泌乳素形成的复合物具有比单体泌乳素更长的半衰期[7],会造成巨泌乳素在血中的聚集,从而导致泌乳素水平的测值升高。

2.3 不同检测平台受干扰现状

由于不同检测平台所使用的反应抗体有所不同,同时巨泌乳素的空间结构有差异,巨泌乳素虽然在不同检测平台的泌乳素免疫测定中都会发生反应,但是反应程度不同[6]。SMITH等[11]利用目前使用较为广泛的9种泌乳素免疫测定法评估含有巨泌乳素血清的反应性,结果发现不同方法测定结果有2.3～7.8倍的差异,并且所有结果均高于对单体泌乳素浓度的估计。对于当前泌乳素的主要检测平台,Tosoh AIA对于巨泌乳素的反应最强烈,西门子Centaur、贝克曼 Access和罗氏 Elecsys相对较弱。KELLY等[12]使用目前的参考范围和严格的巨泌乳素血症定义,通过两种不同的测定系统诊断巨泌乳素血症,使用Tosoh AIA分析,在3 101个连续的常规样本中有670个表现出高泌乳素,其中165例(24.6%)确诊为巨泌乳素血症。当用反应性较低的Roche Elecsys Ⅱ测定法重新测定高泌乳素血症样品时,只有79例(11.8%)确诊为巨泌乳素血症。HATTORI等[13]研究发现抗泌乳素自身抗体可识别人泌乳素N和C末端残基上的表位。泌乳素测定中的反应性不同可能是因为巨泌乳素的自身抗体在不同程度上掩盖了免疫测定捕获或检测抗体靶向的表位[14]。

虽然在不同检测系统上巨泌乳素的反应性有所不同,但是联合多平台检测并不能提高巨泌乳素的检出率。一项回顾性研究选取了70例高泌乳素血症患者分别在雅培I 2000和贝克曼系统检测,结果发现雅培I 2000检出巨泌乳素血症29例,贝克曼检出巨泌乳素血症20例,两系统同时判定巨泌乳素血症15例,联合检测检出率与二者相比无统计学差异,可见联合检测并不能提高巨泌乳素的检出率,而会提高检测成本[15],更重要的是选择合适的巨泌乳素检测方法,优化实验室高泌乳素血症的诊断流程。

3 巨泌乳素的测定方法

选择合适的巨泌乳素测定方法对于实验室巨泌乳素的筛查具有重要意义。测定巨泌乳素的参考方法是色谱法,文献报道一种利用高效液相色谱(HPLC)的方法,通过超滤去除巨泌乳素再进行血清泌乳素的测定,具有常规适用性[16]。聚乙二醇沉淀法是目前应用较多的检测方法,此外还有蛋白质A/G色谱柱或125I泌乳素结合剂法。

3.1 凝胶过滤色谱法

凝胶过滤色谱法(Gel filtration chromatography,GFC)被认为是巨泌乳素测定的金标准和参考方法,这是一种基于体积差异的分离方法。固定相由一列多孔珠组成,孔径范围明确。它具有分馏范围,可以分离该分子量范围内的分子。足够小的蛋白质可以通过珠子的孔内,并被称为“内含物”。这些较小的蛋白质可接近珠粒内部的流动相以及珠粒之间的流动相,最后在凝胶过滤分离中洗脱,太大而不能塞入珠孔的蛋白质被排除在外,只能进入微珠之间的流动相,因此首先洗脱。将含有巨泌乳素的样品用此类色谱柱时,巨泌乳素将首先洗脱,然后是大泌乳素和单体泌乳素,当巨泌乳素线下的面积大于泌乳素洗脱总面积的30%时,即巨泌乳素阳性[17]。GFC法不仅可以测定所有形式的泌乳素,而且可以估算其分子量,但其费时费力,且成本较高,应用受到一定的限制,通常不适合常规临床实验室。

3.2 聚乙二醇沉淀法

目前应用最为广泛的是聚乙二醇(poly-ethylene-glycol,PEG)沉淀法,PEG沉淀法是将待测血清与25%PEG混合后,孵育一定时间,然后离心沉淀巨泌乳素复合物,取离心后的上清液测定泌乳素,和未处理的血清样品泌乳素测定结果进行比较。一般认为PEG沉淀后回收率≤40%是诊断巨泌乳素血症的标准。但是有研究[18]认为此标准存在缺陷,因为它无法识别出以巨泌乳素为主要形式但同时单体泌乳素也升高的情况,而这一情况更具有病理意义。因此目前有两种方式报告巨泌乳素血症的存在即PEG沉淀后回收率或PEG沉淀后泌乳素浓度,用回收率诊断多认为≤40%或≤60%时存在巨泌乳素血症,使用回收率≤60%的标准可检测到更多的巨泌乳素血症患者[19]。但是当巨泌乳素与高浓度的单体泌乳素同时发生时,推荐同时使用PEG沉淀前后的泌乳素浓度作为参考,防止漏诊或误诊。

PEG沉淀法简单、快速且成本较低,同时还可以用于检测类似的由于内源抗体与测定试剂反应而产生的干扰。但值得注意的是该方法的特异性有限,部分单体泌乳素可能与免疫球蛋白共沉淀,使回收率降低,特别是在血清球蛋白浓度升高疾病(单克隆丙种球蛋白病或多克隆性高丙种球蛋白血症)患者中可能造成假性巨泌乳素血症的错误诊断[20]。

3.3 巨泌乳素检测方法的选择

目前常用的巨泌乳素检测方式每一种都有其优势和不足。KAVANAGH等[21]用41例巨泌乳素血症患者血清比较了几种检测巨泌乳素的方法的特异性和临床实用性,研究发现所有预处理血清中的泌乳素残留浓度与GFC后获得的单体浓度均有不同,但是PEG沉淀法与GFC法一致性最高,因此虽然所检查的方法均未产生与GFC方法相同的结果,但PEG预处理产生的结果最好,被推荐作为GFC的首选替代方法。目前聚乙二醇沉淀广泛用于检测巨泌乳素,并且可以用于检测类似的大分析物以及由于内源抗体与测定试剂反应而产生的干扰[22]。

4 巨泌乳素血症实验室诊断路径

诊断高泌乳素血症必须根据已知原因进行鉴别诊断,尤其是巨泌乳素导致的高泌乳素血症。如果存在巨泌乳素血症,单体催乳素的浓度是正常的,则无需其他进一步检查。仅凭临床表现无法将巨泌乳素血症和真正的泌乳素过多症区分,因此需要基于实验室检测的解决方案,建立巨泌乳素血症的实验室诊断路径,见图1。包括受干扰样本的筛选,选择适合巨泌乳素测定方法,设定PEG沉淀后单体泌乳素的参考范围和报告方式。

图1 PEG沉淀法筛查巨泌乳素血症诊断路径图

4.1 受干扰样本的筛选

高泌乳素血症诊断指南建议对所有无症状高泌乳素血症患者进行巨泌乳素血症检测[23]。但是由于部分巨泌乳素血症患者经常伴有高泌乳素的临床症状,会导致误诊漏诊,进行不必要的进一步诊治,因此建议对所有高于参考上限的进行巨泌乳素血症的筛查[24]。MILICA等[25]研究发现将临界值从制造商的参考上限提高到32.9 μg/L并不会明显改变巨泌乳素血症的检出率;若临界值提高至47.0 μg/L会使超半数巨泌乳素血症患者被漏诊。因此研究建议根据各实验室免疫测定平台的不同,建立自己的筛查临界值,同时发现对于随访患者1年内巨泌乳素变化差异不大的,可不再进行重复筛查。

4.2 检测流程与临床报告

实验室研究应着重于对具有生物活性的泌乳素即单体泌乳素的测定,这可以为临床医生提供最有用的信息。PEG沉淀后的泌乳素浓度提供了生物活性单体泌乳素的相对准确的量度。但是由于各个检测平台对于泌乳素的反应性不同,因此应设定单体泌乳素特定的参考区间,才可有效减少假性高泌乳素的发生。建立实验室巨泌乳素检测的筛查流程,设置特定的巨泌乳素参考范围及诊断标准,对于为临床提供准确的单体泌乳素浓度具有重要意义。MILICA等[25]进行了1项回顾性研究,巨泌乳素血症由PEG沉淀后回收百分率和PEG沉淀后的泌乳素浓度诊断,通过对1 136例患者在罗氏cobas e601上PEG沉淀前后泌乳素浓度的测定,建立了实验室巨泌乳素诊断路径,如图1所示。在报告结果时应同时报告PEG沉淀后回收百分率和PEG沉淀后的泌乳素浓度,并注明实验室PEG沉淀后单体泌乳素的参考区间,有助于临床医生对于巨泌乳素血症的诊断,有效减少假性高泌乳素血症的误诊和误治。

综上所述,巨泌乳素是免疫法泌乳素中最常见的干扰因素。实验室应根据实验室检测系统为所有高泌乳素血症病例引入筛查流程,建立筛查方法,设定自己的巨泌乳素参考范围及诊断标准。