siRNA抑制大鼠心肌细胞MagT1基因表达的研究

滕飞翔 吴隽松

Mg2+是活细胞中含量最丰富的二价阳离子之一，是多种酶的辅助因子，还是维持大分子有活性的构象，脂类和磷酸肌醇类第二信使的调控，多种离子通道和转运体的调控所必需的［1～11］。有研究表明Mg2+入胞会通过 Mg2+转运体等来实现，目前至少有七种跨膜转运 Mg2+转运体被发现［12～14］。MagT1是一种特异性的Mg2+转运体，可能在Mg2+转运过程中起重要作用。临床观察表明，心肌细胞内游离Mg2+浓度过低时会导致心律失常等现象［15］。本研究试图确定效果好的小干扰RNA(siRNA)，为深入使用RNA干扰方法研究MagT1在大鼠心肌细胞中的功能，最终治疗相关心脏疾病奠定基础。

1.材料和方法

1.1 材料 1天SD大鼠购于南通大学实验动物中心;逆转录和RT－PCR试剂盒购自大连宝生物公司;MagT1 siRNA购于上海吉玛公司;siRNA转染试剂购自Invirgen公司;α－actin蛋白一抗和荧光二抗购自美国abcam公司。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 大鼠心肌细胞的体外分离和siRNA转染:选择10只出生1天的SD大鼠乳鼠，在超净台里取出心脏，剪下心尖部分，减碎置于小瓶中，加入胰酶和Ⅰ型胶原酶混合物在37℃环境中震荡消化，反复几次，将分离下来的心肌细胞收集起来，铺在培养皿中，24小时后鉴定心肌细胞纯度。将4对siRNA和转染试剂按照说明书中的比例混合起来，加入心肌细胞培养皿中，60小时后进行后续反应。

siRNA2 5'－GCGACGAAGUAAUAUGGAATT－3';5'－UUCCAUAUUACUUCGUCGCTT－3'siRNA3 5'－GGCAAGGAACGACUUAUAATT－3';5'－UUAUAAGUCGUUCCUUGCCTT－3'siRNA4 5'－GAUUGGACUUGUUGUGUUATT－3';5'－UAACACAACAAGUCCAAUCTT－3'

1.2.2 总RNA提取、逆转录及RT－PCR反应:将Trizol加入转染过MagT1 siRNA的心肌细胞培养皿中，随后按照Trizol说明书上的步骤提取细胞总RNA。使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录，然后使用PCR试剂盒进行PCR反应，检测siRNA的下调效果。

1.3 统计学方法 PCR实验重复3次，数据采用SPSS11.0软件进行统计分析，结果以±s(平均数±标准误)表示，组间比较用t检验。检验结果P＜0.05有显著差异。

2.结果

2.1 大鼠心肌细胞鉴定 本研究选择一种心肌细胞特有的α－actin蛋白的一抗［16］进行免疫荧光反应，散发绿色荧光的细胞是心肌细胞(见图1A)。选取10个不同视野，每个视野点数200个细胞。2000个细胞中被染色的细胞有1932个，即心肌细胞纯度为1932/2000×100%=96.6%。

图1 大鼠心肌细胞中α－actin蛋白和细胞核的定位(40×)

2.2 RT－PCR反应检测siRNA沉默效果 向大鼠心肌细胞转染4对siRNA 60小时后，通过RT－PCR实验检测siRNA对MagT1沉默效果。结果显示(图2)，siRNA1、siRNA2、siRNA3灰度值分别为0.85±0.03(P＞0.05)，0.65±0.04(P＞0.05)，0.73±0.04(P＞0.05)。siRNA4的灰度值是 0.13±0.03(P＜0.01)，沉默效果最好，因此选择siRNA4进行后续实验。

图2 4对siRNA沉默效果的鉴定

3.讨论

Mg2+是哺乳动物细胞中含量最丰富的二价阳离子之一，细胞核、线粒体和内质网是细胞内Mg2+聚集和储存的主要部位。Mg2+参与细胞内多种生命活动，它是多种酶的辅助因子，可以参与维持大分子有活性的构象，脂类和磷酸肌醇类第二信使的调控，电荷补偿等生理活动。另外Mg2+可以调节平滑肌的松弛、冠状动脉和末梢血管的膨胀、发挥抗心律失常药的效果，因此心血管系统的健康与Mg2+有关［17～20］。

MagT1是一种特异性Mg2+转运体，对于Mg2+通透性最大，因此有可能是Mg2+进入心肌细胞内部的重要途径之一。为了用RNA干扰方法研究心肌细胞中MagT1的功能，首先要确定沉默效果好的siRNA。本研究体外分离了心肌细胞，并设计、合成了4对siRNA，随后使用RT－PCR方法从4对siRNA中筛选出了沉默效果最好的1对，序列为5'－GAUUGGACUUGUUGUGUUATT－3';5'－UAACACAACAAGUCCAAUCTT－3'，从而为深入研究MagT1在心肌中的功能奠定了一定的基础。

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