Histatin5可溶性突变体融合蛋白在大肠杆菌中的优化表达

刘 洁

(1.武汉大学基础医学院，湖北武汉430071;2.湖北科技学院护理学院)

Histatin5(HST5)能有效杀灭耐药的白色念珠菌，是极具潜力的防治口腔疾病药物［1］。因唾液中HST5含量低微，不易提取;化学合成成本高。利用基因工程生产HST5值得尝试。

大肠杆菌是常用的外源蛋白表达系统，但表达量受多种因素影响［2］，需优化表达条件以提高表达量。本文拟优化部分表达条件，提高突变体HST5与谷光甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(GST-HST5)在大肠杆菌BL21中的表达量，为获取重组HST5奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

含重组质粒(插入HST5突变体)的大肠杆菌BL21(BL21-pGEX4T-2-hst5)及含空质粒pGEX4T-2的BL21(BL21-pGEX4T-2)由湖北科技学院生化教研室提供。

1.1.2 主要试剂

IPTG为 TaKaRa公司产品，Yeast Extract、Tryptone为Oxiod公司产品，水为MilliQ超纯水，蛋白Marker为Fermentas公司产品，氨苄青霉素(Amp)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、DTT、PMSF、Triton-X 100购自上海生工生物公司。

1.2 方法

1.2.1 重组融合蛋白的SDS-PAGE检测

将BL21菌液划线于 LB固体平板，BL21-pGEX4T-2、BL21-pGEX4T-2-hst5菌液划线于含100μg/ml Amp的 LB(下称 LBAmp)固体平板，37℃，倒置培养12h。将BL21单菌落接种于LB中，BL21-pGEX4T-2、BL21-pGEX4T-2-hst5单菌落接种于 5ml LBAmp中，37℃，200rpm培养至OD600 0.6，于 BL21-pGEX4T-2、BL21-pGEX4T-2-hst5菌液中加入终浓度0.5mmol/L IPTG，培养4h。5000rpm，室温离心5min，弃上清，PBS重悬沉淀一次，离心，弃上清，于沉淀中加入300μl破菌缓冲液(含 1 × PBS、10mM DTT、1 mM PMFS、1%Triton-X 100)。按40W 功率，超声5s，间歇5s的程序，冰浴超声30min。5000rpm，4℃ 离心5min，取上清 240μl，加 80μl 4 × Loading Buffer，混匀，100℃ 变性10min，短暂离心，备用。

取样品各10μl，上样于15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，以预染蛋白Marker作蛋白分离程度的指示剂，待10KD Marker距凝胶底部约5mm时停止电泳。卸胶，加考马斯亮蓝浸泡凝胶，振荡，染色1h。回收染色液，加脱色液脱色至条带清晰、无蓝色背景，扫描拍照。

1.2.2 IPTG诱导浓度

确认融合蛋白表达成功后，取5支试管，各加入5ml LBAmp，接种BL21-pGEX4T-2-hst5单菌落，37℃，培养至 OD600 0.6，依次加入0.2、0.6、1.0、1.5、2mmol/L IPTG，培养4h。按1.2.1提取蛋白、电泳、染色、脱色、扫描。

1.2.3 诱导后培养时间

以1.2.2获得的最佳IPTG诱导浓度，诱导后依次培养2、4、6、8、10、12h，按1.2.1 提取蛋白、电泳、染色、脱色、扫描。

2 结果

2.1 融合蛋白成功表达

由图1知，4泳道有一分子量较空载体表达的GST(26KD)略大的蛋白(箭头示)，与融合蛋白GST-HST5分子量(29KD)相符，表明融合蛋白表达成功。

图1 SDS-PAGE检测重组融合蛋白的表达

2.2 IPTG诱导浓度

由图2知，IPTG浓度在1.0mmol/L内，融合蛋白表达量随IPTG浓度升高而增加;浓度大于1.0mmol/L时，随IPTG浓度升高，融合蛋白表达量有下降趋势(箭头示)。

图2 IPTG诱导浓度对表达量的影响

2.3 诱导后培养时间

由图3可见，在诱导后6h内，融合蛋白表达量随诱导后培养时间延长而增加;诱导时间超过6h后，随培养时间延长，融合蛋白表达量明显下降(箭头示)。

图3 诱导后培养时间对表达量的影响

3 讨论

诱导后培养时间对表达量影响明显。诱导后6h内，菌体生长旺盛，表达外源蛋白的能力强，此段时间内表达量上升与菌体总量增长成正相关;随着时间延长，培养基逐渐减少，导致营养匮乏，菌体生长状态不佳，甚至死亡，表达能力下降或丧失，具有表达活性的菌体总量逐步减少，以致表达量减少，死亡的菌体释放蛋白酶，降解胞内融合蛋白。

IPTG诱导浓度对表达量的影响。IPTG浓度在1.0mmol/L以下时，其对载体Lac-Z动子的诱导作用尚未饱和，故随着浓度的升高，诱导作用增强，蛋白表达量提高。继续提高IPTG浓度时，因诱导作用饱和，过多的IPTG可能对细胞产生一定毒性，导致细胞生长状态受影响，表达量呈现下降趋势。

诱导后培养温度等因素对GST-HST5的表达也可能存在影响，需进一步实验探索。

综上述，Histatin5突变体融合蛋白在大肠杆菌中的优化表达条件为:1mmol/L IPTG，37℃诱导6h。

［1］Oppenheim FG，Xu T，McMillian FM，et al.Histatin，a novel family of histidine-rich proteins in human parotid secretion，isolation，characterization，primary structure and fungistatic effects on Candida albicans［J］.Biol Chem，1988，263:7472

［2］刘变芳，郭蔼光，金伟波，等.果蝇抗菌肽基因(Andropin)的原核表达与活性分析［J］.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2010，38(7):119