白藜芦醇在大鼠肝微粒体中的代谢动力学研究

任 平，王文斌

(1.湖北科技学院药学院，湖北咸宁437100;2.咸宁市中心医院)

1 材料与方法

1.1 仪器

Shimadzu N3000高效液相色谱系统(北京创新通恒)，3-30K高速台式冷冻型离心机 (德国sigma公司)，美国Biotek synergy2多功能酶标仪，分析天平(A＆D.Company.L imited.Tokyo.Japan)

1.2 试剂与药品

白藜芦醇(纯度≥98%，由西安天一生物工程技术有限公司提供)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)，葡萄糖-6-磷酸单钠盐(glucose-6-phosphate monosodiun salt，G-6-P)，辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)均为美国Sigma公司产品，BCA试剂盒(南京建成)，地塞米松磷酸钠注射液(江苏涟水制药有限公司)，苯巴比妥钠(上海新亚有限公司)，其余均为国产分析纯化学试剂。

1.3 试验方法

1.3.1 大鼠预处理

9只健康雄性SD大鼠(Sprague-Danley)给予普通饲料喂养1周后，随机分为3组，即正常对照组、苯巴比妥诱导组、地塞米松诱导组。对照组腹腔注射生理盐水10ml·kg-1·d-1，连续3d;PB组PB溶于生理盐水，腹腔注射80mg·kg-1·d-1，连续3d;DEX组DEX腹腔注射75mg·g-1·d-1，连续3d。

1.3.2 肝微粒体的制备

动物末次给药24h后断头处死动物，剖腹，用注射器吸取经冰浴冷却的生理盐水，经胸动脉或门静脉注入肝脏，灌流，除去肝中血液。取出肝脏，采用钙沉淀法［4］制备肝微粒体。以BCA法［5］测定肝微粒体的蛋白浓度。

1.3.3 温孵条件

郭文安：从五院校《教育学》到《教育学》(新编本)(王道俊、王汉澜主编)再到《教育学》(第六版、第七版)(王道俊、郭文安主编)，我们经历了一个从蒙昧到启蒙，再发展到自觉求索的历程。

孵育体系总体积250μl，反应体系中包含新鲜配制的 NADPH再生系统(NADP 4mmol·L-1，G6PD 4μmol/ml·ml-1，G6P 10mmol·L-1)，微粒体蛋白(1g·L-1)，0.1mol·L-1Tris-0.3mol·L-1KCl-20mmol·L-1MgCl2缓冲液(pH7.4)。白藜芦醇和酮康唑用不同比例的甲醇配制，反应体系中甲醇终体积分数小于1%。反应于37℃水浴中温孵震荡，预孵5min，加入NADPH启动反应，反应完毕立即取出，加入乙腈0.5ml终止反应。

1.3.4 样品处理

肝微粒体温孵反应结束后，立即加入0.5ml乙腈，振旋 3min，12000rpm 离心 5min，取上清20μl进HPLC系统，采用峰面积外标法定量分析，测定白藜芦醇的浓度。

1.3.5 色谱条件

色谱柱为 Nucleodur C18(250mm×4.6mm，5μm)反相柱;流动相为超纯水-乙腈(35∶65，V∶V);检测波长为303nm;流速为1.0ml·min-1;柱温为 25℃;进样量为 20μl。

1.3.6 白藜芦醇代谢的酶促动力学研究

白藜芦醇(终浓度为 6.25，12.5，25，50，75 和100μmol·L-1)在空白对照组和DEX组的肝微粒体(蛋白浓度为1g·L-1)的反应体系中，在37℃的条件下温孵30min。

1.3.7 白藜芦醇在各诱导剂组大鼠肝微粒体温孵液中代谢影响的比较

将各组肝微粒体组分悬浮液适量(蛋白浓度为 1g·L-1)分别与白藜芦醇(25，50μmol·L-1)在NADPH再生温孵体系中共同温孵，观察白藜芦醇在各温孵体系中的代谢。

1.3.8 代谢抑制实验

孵育条件同前，孵育体系中白藜芦醇浓度为50μmol·L-1，微粒体蛋白质量浓度为 1mg·ml-1，孵育时间为30min，实验中所用的酮康唑浓度为6.25，12.5，25，50，100μmol·L-1，对照组用等量的缓冲盐代替抑制剂。抑制程度按抑制剂浓度为0时代谢量为100%计算。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 线性范围及最低检测限

在每200μl空白对照组肝微粒体中，分别加入白藜芦醇一系列标准品溶液，配制浓度分别为0.5，1，2，4，8，16，32，64，132μmol·L-1，按上述样品处理步骤操作，并进行色谱分析。以白藜芦醇标准对照品的峰面积(Y，A)对相应的浓度(X，μmol·L-1)进行线性回归，得血浆标准曲线方程为:Y=60.573+3795.1，r=0.9991，线性范围 0.5～132μmol·L-1。本法测定肝微粒体中白藜芦醇的最低定量限为0.03μmol·L-1。

2.2 白藜芦醇在大鼠肝微粒体酶中的代谢

2.2.1 微粒体酶对不同浓度白藜芦醇的代谢

在蛋白质量浓度为1g·L-1的DEX诱导组和空白对照组的肝微粒体酶中，分别加入不同浓度的白藜芦醇(终浓度 3.125，6.25，12.5，25，50，100μmol·L-1)，37℃水浴中孵育 30min，测定白藜芦醇浓度。以白藜芦醇原始浓度为横坐标，对白藜芦醇代谢速率为纵坐标作图。由图可见，当白藜芦醇浓度大于50μmol·L-1，其代谢速率并未随白藜芦醇浓度的增加而呈线性增加，表现出明显的代谢饱和特性。且白藜芦醇在DEX诱导组的代谢速率明显高于空白对照组，结果见图1。

图1 白藜芦醇在地塞米松与空白对照组的肝微粒体中代谢速率的比较

2.2.2 白藜芦醇在不同诱导组大鼠肝微粒体的代谢

经DEX，PB诱导后，白藜芦醇在大鼠肝微粒体中的代谢明显提高，其代谢速率分别与空白对照组比较差异有显著性(P＜0.01)，结果见表1。

表1 白藜芦醇在不同处理组的消除速率比较(s，n=3)

表1 白藜芦醇在不同处理组的消除速率比较(s，n=3)

与对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与 DEX 比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 底物浓度(μmol·L-1)剩余浓度(nmol·L-1)代谢速率(nmol·min-1·mg protein-1)DEX组25 4.05±0.52* 1.42±0.007*50 8.97±1.47* 3.27±0.02＊＊PB组25 8.05±1.53* 1.06±0.03＊＊#50 10.47±3.49* 2.16±0.04＊＊##25 10.95±4.33 0.35±0.01 50 24.07±5.93 0.73±0.03对照组

2.2.3 CYP3A特异性抑制剂对白藜芦醇代谢的影响

CYP3A的特异性抑制剂Ket在6.25μmol·L-1可以抑制白藜芦醇的代谢(P＜0.01)，降低白藜芦醇的代谢速率，并呈现一定的浓度依赖性。以抑制剂的浓度为横坐标，药物的代谢率为纵坐标(按抑制剂浓度为0时代谢量为100%计算)作图，结果见图2。

图2 CYP3A选择性抑制剂对大鼠肝微粒体中白藜芦醇代谢的影响，白藜芦醇浓度为25μmol·L-1(n=3，s)

3 讨论

以肝脏为基础的微粒体代谢模型，以其特有的优势在药物代谢研究中得到广泛应用。一般采用特异性诱导剂在体诱导肝微粒体CYP450，用其微粒体孵育，DEX主要诱导CYP3A，PB主要诱导CYP2B、2C。此方法能比较全面地反映药物在生物体内的代谢情况，具有制备方便、重现性好，酶混合体系易保存和孵育条件易优化等优点［6］。研究结果显示，白藜芦醇在大鼠肝微粒体中被迅速代谢;在 3.125～50μmol·L-1，蛋白质量浓度为1mg·ml-1，白藜芦醇代谢基本呈线性消除。当白藜芦醇浓度超50μmol·L-1时，药物的消除速率不再随底物浓度的增加而呈线性增加，表现出代谢的饱和特性。观察白藜芦醇在诱导后的大鼠肝微粒体温孵液中代谢，结果表明，白藜芦醇在DEX，PB，诱导的大鼠肝微粒体中的代谢明显提高，其代谢率与空白对照组相比差异有显著性(P＜0.01或P＜0.05)。这说明 CYP3A、CYP2B、CYP2C可能参与白藜芦醇的代谢。在PB诱导的大鼠肝微粒体中的代谢明显低于其在DEX组中的代谢(P＜0.01)，可见CYP2B、CYP2C虽然可能参与白藜芦醇的代谢，但其催化白藜芦醇代谢转化的作用仅处于次要地位。且CYP2B对肝脏药物代谢的作用较为有限，故CYP2B参与其代谢意义不大。PB虽然主要诱导 CYP2B，CYP2C，同时也诱导CYP3A［7］，这提示PB诱导的肝微粒体内白藜芦醇代谢的加快可能还与CYP3A被诱导有关。通过研究CYP3A特异性抑制剂Ket对白藜芦醇代谢的影响进一步了解白藜芦醇代谢与CYP3A的关系。本实验中Ket可以显著地抑制白藜芦醇在肝微粒体温孵液中的代谢，该抑制作用有剂量依赖性。此结果进一步表明CYP3A可能是催化白藜芦醇代谢的主要亚酶。药物代谢性相互作用是影响药物在体内浓度水平的一个重要因素。如果抑制白藜芦醇经CYP3A，CYP2B，CYP2C的代谢，将会降低其代谢速率，提高白藜芦醇在体内的水平。这提示CYP3A，CYP2C，CYP2E1的抑制剂与白藜芦醇之间有潜在的药物相互作用，前者可以降低白藜芦醇的代谢速率。本研究对白藜芦醇体外代谢作了初步的探讨，为进一步药物相互作用研究和进行开发利用提供实验基础和理论依据。

［1］黎永胜，文军.白藜芦醇的药理作用研究进展［J］.医学综述，2008，14(3):469

［2］周丽，董永海，胡传来，等.HPLC法测定葡萄汁(酒)中的白藜芦醇和白藜芦醇苷［J］.营养学报，2010，32(1):86

［3］张瑞，汪电雷，张弦，等.高效液相色谱法测定大鼠血浆中白藜芦醇含量及其药物代谢动力学［J］.安徽中医学院学报，2010，29(5):56

［4］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.北京:人民卫生出版社，1994:489

［5］方福德，周吕，丁濂，等.现代医学实验技巧全书(上册)［M］.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995:562

［6］Donato MT，Castell，JV.Strategies and molecular probes toinvestigate the role of cytocbrome P450 in drug metabolism［J］.Clin Pharmacokinet，2003，42:153

［7］Morrison VM，Burnett AK，Crafe JA.Metabolism of 7，12-dimethyl-benz［a］anthracene in hepatic microsomal membranes from rats treated with isoenzyme selective inducers of cytochromes P450［J］.Biochem Pharmacol，1991，41(10):1219