青光眼药物治疗患者泪液中P 物质的表达及与干眼症发生率的相关性

李璐希，刘 伟，季 建

（天津医科大学眼科医院青光眼科，天津 300384）

青光眼是一类不可逆性致盲性眼病，药物治疗依然是医生和患者首选的治疗手段。许多研究证实[1-3]，抗青光眼药物会对患者眼表的泪液所含的正常成分产生影响，从而导致眼部不适及干眼症。而神经肽P 物质（substance P，SP）是主要由感觉神经末梢分泌的一类神经肽，属于正常人泪液中的一种成分，它广泛分布于中枢神经系统和周身各组织器官，在很多细胞中质量浓度都很丰富，如三叉神经、视神经等[4]，其中三叉神经的感觉神经支配着角膜。近期研究发现，SP 在某种程度上反映眼表器官中神经肽的质量浓度[1-2]，对组织愈合修复有着重要作用并对维持眼表微环境的稳定发挥重要的作用[3]。但至今尚未有文献报道青光眼药物治疗对患者泪液中SP 质量浓度的影响及与干眼三者之间的联系，本研究采用ELISA 检测SP 在30例正常人和40例接受药物治疗青光眼患者泪液中的质量浓度，从用药时间和用药种类上分析抗青光眼药物对泪液中SP 浓度的影响，以及SP 质量浓度与青光眼干眼症发生率之间的相关性，探讨药物治疗青光眼对SP的影响以及明确SP 在泪液和眼表中的作用与眼表疾病尤其是干眼的发病关系，以期为临床药物治疗青光眼时对干眼的治疗从病因及可能的发病机制方面提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 药物治疗组 天津医科大学眼科中心确诊为青光眼住院病人40例，年龄40～70 岁，平均年龄为52 岁。病例入选标准：眼压≥21 mmHg；正在接受抗青光眼药物治疗的青光眼患者。病例排除标准：糖尿病患者；局部患有影响眼表功能的疾病（如睑缘炎、泪囊炎、角结膜干燥综合征、类天疱疮等）；眼部手术史者；佩戴角膜接触镜史。其中在用药时间上，大于3月组和小于等于3月组各20例眼；在用药种类上，单独用药治疗组10例，联合两种用药治疗组14例，联合3 种用药治疗组16例。

1.1.2 对照组 无角膜接触镜佩戴史的健康自愿者30 眼，年龄38～67 岁，平均年龄为50 岁。入选标准：无干眼症状史、眼部疾病史、眼部手术史、戴角膜接触镜史、眼部过敏史、糖尿病史；Schirmer 试验>10 mm，泪膜破裂时间（breakuptime，BUT）＞10 s。

1.2 样本采集 所有个体均进食早餐，泪液于上午10:00-11:00，在相同条件下采集。用20μL 玻璃毛细管轻置于患者下结膜囊取泪液标本5μL，采用加压方法，注入50μL 0.9%生理盐水Ep 管中，-20℃保存备用。

1.3 SP 浓度的测定（ELISA 法）将浓缩洗涤液用双蒸水稀释20 倍。加入10μL 标准品和样本于相应反应板孔中。每孔加入50μL Anti SP Biotin 和50μL SP POD，室温温育45 min，甩尽板内液体，洗涤后每孔内加入350μL 洗涤液及100μL 显色液，室温孵育20 min。每孔加入100μL 终止液，30 min内在450 nm 处读取OD 值。依样本稀释的比例还原成纯泪液中SP 的质量浓度。

1.4 干眼诊断标准 综合考虑患者症状和临床眼部客观检查结果，参考张梅等[5]的诊断标准：（1）眼表评分结果阳性（包括了眼部症状和眼表活体染色的评分）；（2）SchirmerⅠ检查值＜10 mm/min；（3）BUT检查结果＜5 s。以上3 项结果均为阳性者诊断为干眼症。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0 统计学软件进行统计处理，实验数据用±s 表示，两样本均数比较采用t 检验，多个组的总体均数比较采用方差分析，组间率比较采用χ2检验或Fisher 确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物治疗组与正常组泪液SP 质量浓度比较 正常组年龄（50.00±8.75）岁，药物治疗组年龄（52.00±9.06）岁，采用两独立样本的t 检验，t=0.927，P=0.36＞0.05，差异无统计学意义。40例接受药物治疗的青光眼患者及30例正常人泪液SP 质量浓度检测结果见表1。可以看出药物治疗组与正常人群相比，眼表泪液SP 质量浓度降低（P<0.05）。

表1 SP 在药物治疗组与正常组泪液中的浓度（pg/mL，±s)Tab 1 SP concentration in the medication group and the normal group（pg/mL，±s)

表1 SP 在药物治疗组与正常组泪液中的浓度（pg/mL，±s)Tab 1 SP concentration in the medication group and the normal group（pg/mL，±s)

2.2 用药时间对药物治疗组泪液SP 质量浓度的影响 20例用药时间≤3月组泪液SP 质量浓度与20例用药时间＞3月组泪液SP 质量浓度检测结果见表2。采用两独立样本的t 检验，t=3.306，P＜0.05，两组的差异有统计学意义。可以看出用药时间延长，会导致泪液SP 质量浓度下降。

表2 用药时间对药物治疗组泪液SP 质量浓度的影响（pg/mL，±s)Tab 2 The effect of medication time on the SP concentration（pg/mL，±s)

表2 用药时间对药物治疗组泪液SP 质量浓度的影响（pg/mL，±s)Tab 2 The effect of medication time on the SP concentration（pg/mL，±s)

2.3 药物种类数对药物治疗组泪液SP 质量浓度的影响 单独用药组泪液SP 质量浓度为（264.78±5.50）pg/mL，联合两种用药组泪液SP 质量浓度为（258.00±10.20）pg/mL，联合3 种用药组泪液SP质量浓度为（254.16±6.85）pg/mL。采用方差检验，F=5.518，P＜0.05，3 者之间差异有统计学意义。可以看出用药种类增加后，会导致泪液SP 质量浓度降低。

2.4 药物治疗组泪液SP 质量浓度与干眼之间的相关性 在40例药物治疗组患者中有25例被诊断为干眼，对药物治疗组泪液SP 质量浓度（258.16±8.81）pg/mL 与干眼进行Spearman 相关性检验，r=-0.584，P＜0.05。可以认为药物治疗组泪液SP 质量浓度与干眼之间呈负相关。

2.5 用药时间和联合用药数量与患者干眼之间的相关性 用药时间长短和联合用药数量与确诊为干眼的眼数之间应用χ2检验，所得结果分别为χ2=5.23，P＜0.05；χ2=6.601，P＜0.05，差异有统计学意义。实验结果表明用药时间长短和联合用药数量与患者干眼发生率有关。见表3。

表3 用药时间和联合用药数量与患者干眼之间的相关性Tab 3 Correlation of medication time and number with dry eye

3 讨论

速激肽家族属于一种神经肽，是存在于脊椎动物和非脊椎动物体内的进化保守的肽家族，由神经元细胞产生无活性的前速激肽元在翻译后加工成为不同的神经肽。研究发现速激肽（tachykinins）在中枢和外周神经系统中通过与G 蛋白耦联的受体相互作用可以作为正常细胞的潜在生长因子。而速激肽家族第一个被发现的成员是SP，1931年Von Euler 和Gaddum 在马的小肠和脑中发现一种能引起肠平滑肌收缩和血压下降的粉末状物质，由于当时不知道其化学性质和结构，于是按英文名称的第一个字母命名为SP[6]。虽然早在1936年就已经认识到SP 是一种多肽物质，但直到1970年才由Chang 等[7]从下丘脑中分离和纯化了SP，进而阐明了其结构。

SP 广泛分布于神经系统和外周组织中，研究发现，在正常角膜组织中，三叉神经网状结构多分布在位于上皮下的浅基质层内，有研究采用免疫荧光法等技术观察到在角膜上存在分泌SP 的神经末梢[8-9]。在创伤后由感觉神经末梢释放SP 到周围组织中，成为神经系统调控伤口愈合的重要介质；还有文献报道，它还参与了神经源性炎症反应的发生、发展。目前，已有研究发现泪液中不同的SP 质量浓度关联到一定程度的眼表功能失调[10]，例如在变应性结膜炎和春季角膜结膜炎患者泪液中SP 质量浓度明显增加[11]，而角膜知觉减退眼和对侧健眼相比SP 的质量浓度是降低的，并且在糖尿病性角膜炎患者中SP 的质量浓度比正常人亦降低[11]。那么SP在青光眼用药以及干眼发生之间起着什么作用呢？

本研究采用ELISA 检测SP 在正常人和接受药物治疗青光眼患者泪液中的质量浓度并作比较，对照组泪液中SP 的质量浓度和Yamadda 等[12]研究的正常人泪液中SP 的质量浓度是一致的。结果表明接受药物治疗青光眼患者泪液中SP 的质量浓度明显低于对照组，差异有统计学意义，这说明对青光眼患者进行药物治疗时，会降低其泪液中SP 的质量浓度。我们还发现在用药时间上，用药时间大于3月组患者泪液中SP 的质量浓度低于用药时间小于等于3月组，这说明随着用药时间延长，药物会降低泪液中SP 的质量浓度；在用药种类上，单独用药组的质量浓度、联合两种用药组的质量浓度和联合3 种用药组的质量浓度三者之间存在明显的差异，可以看出随着用药种类的增加，SP 的质量浓度会降低。而这种改变就可能与抗青光眼药物治疗的时间长短、药物种类有关。又有文献报道长期应用0.25%噻吗洛尔、0.25%倍他洛尔和0.1%地匹福林滴眼液会缩短泪膜的破裂时间，促进结膜上皮细胞向鳞状上皮转化，引起眼干等不适症状[13-15]，从而降低青光眼患者生活质量[15]。笔者推测由于局部抗青光眼药物治疗会对眼表泪液的正常分泌产生影响，抗青光眼药物作用于眼表，药物中添加的防腐剂可损害泪膜的脂质层，导致泪膜稳定性下降；同时，由于长期用药导致结膜杯状细胞的损害，黏液分泌减少，进一步引起BUT 缩短、泪液分泌减少；抗青光眼药物也对结膜和角膜细胞产生毒性副作用，影响眼表三叉神经结构和功能，使角膜表面三叉神经末梢数目减少，从而产生SP 减少，影响SP 的正常质量浓度和功能的发挥，出现眼部不适和干眼症。因此，接受抗青光眼药物治疗会导致泪液中SP 浓度的下降，并且一定程度上与眼表功能失调有密切关联。

本试验中发现在药物治疗组患者中有25例被诊断为干眼，对药物治疗组泪液SP 质量浓度与干眼进行Spearman 相关性检验，发现药物治疗组泪液SP 质量浓度与干眼之间呈负相关，即随着泪液中SP 的降低就有可能会导致干眼发生率的升高，提示SP 对眼表可能发挥营养并具有稳定眼表的作用。这与Nagano 等[16]研究发现相符，他们发现在去三叉神经的神经性角膜炎的动物模型中看到泪液分泌降低，角膜敏感度丧失，上皮屏障功能损害，上皮伤口愈合延迟，用SP 和IGF-1 处理后提高了上皮屏障功能，刺激了角膜上皮伤口愈合。研究可以看出由三叉神经末端释放的SP 在角膜发挥了重要的营养作用。由此笔者推测由于泪液分泌SP 减少，从而导致了泪膜稳定性差，以致青光眼药物治疗时干眼发生率上升。在用药时间和联合用药数量与患者干眼之间的相关性研究中笔者发现用药时间和用药种类与干眼发生率负相关，即用药时间增加和用药种类增多会导致干眼发生率的升高。

综上，笔者认为SP 和泪膜的稳定有一定的关系，在用药与干眼的发生之间都存在密切联系。因此，当确诊为青光眼患者用药时，应关注药物对眼表造成不适，当药物对眼部造成损伤[17]，出现眼部干燥不适时，在临床用药中应控制好用药时间和用药的种类数，同时考虑点用含有SP 营养的滴眼液，促进组织修复同时改善眼部不适症状，提高青光眼患者生活质量[18]。

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