HPLC 法测定家兔模型肠梗阻后血浆中瓜氨酸含量

张春艳，董伟林，王润玲

（1.天津医科大学临床医学院，天津 300270；2.天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津 300070）

瓜氨酸是一种非蛋白质α-氨基酸，是尿素-鸟氨酸循环的中间产物，由肠上皮细胞通过谷氨酸-鸟氨酸途径，从谷氨酰胺代谢中衍生而来[1]，小肠成为血液循环中瓜氨酸的主要来源。已有研究表明，肠梗阻后肠上皮细胞出现损害，血清和小肠组织中瓜氨酸水平可反映残存的小肠上皮细胞数量，越低则说明损害越严重[2]。因此，血液及小肠组织中瓜氨酸浓度水平可作为研究肠梗阻严重程度或肠梗阻模型术前及术后发生急性排斥反应时的监测手段。本试验建立了测定家兔模型肠梗阻后瓜氨酸含量的高效液相色谱法，该方法快速、准确、操作简便，因此可作为血浆中瓜氨酸含量测定的方法，为后续试验比较不同药物如大承气汤、四君子汤对肠梗阻的治疗效果提供了方法学指导[3-4]。

1 材料与方法

1.1 仪器与药品

1.1.1 仪器 日本岛津高效液相色谱仪（SCL-6B色谱系统控制器、LC-6A 输液泵、SPD-6AV 紫外检测仪、Anastar 色谱工作站），MSB010.CX2.5 型离心机(U.K)，YKH-Ⅰ型液体快速混合器（江西医疗器械厂），KQ2200 超声波清洗器（昆山市超声波仪器厂），AR2140 型电子分析天平（上海奥豪斯公司生产）。

1.1.2 试药 瓜氨酸标准品（Alfa 公司提供，含量98%，批号：B2740A）；异硫氰酸苯酯：分析纯（上海金山亭新化工试剂厂，含量99.5%，批号：080410）；甲醇：色谱纯（天津市协和昊鹏色谱科技有限公司，批号：20120328）；乙腈：色谱纯（天津市大茂化学试剂厂，批号：20111205）；其他试剂为分析纯；试验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasi1 C18（150 mm×Φ4.6 mm，5μm）；流动相：0.072 mol·L-1的乙酸钠水溶液∶甲醇∶乙腈=900∶75∶25（再加入10 mmol·L-1的EDTA 溶液125μL）；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温为常温；进样量20μL。

1.2.2 对照品储备液的配制 精密称取瓜氨酸标准品10.0 mg 置于10 mL 棕色量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（每1 mL含瓜氨酸1 mg，相当于5.71 mmol·L-1）。

1.2.3 对照品溶液的配制 精密量取5.71 mmol·L-1的储备液适量，分别置于10 mL 量瓶中，用蒸馏水稀释定容，配制成含瓜氨酸5.71、28.54、57.08、114.16、285.40、570.81、1 141.62μmol·L-1的系列标准溶液，摇匀后备用。

1.2.4 样品的处理 精密取家兔模型肠梗阻后不同时间血浆200μL，加200μL 乙腈，混匀，高速离心5 min，取上清液备用。

1.2.5 衍生化

1.2.5.1 衍生剂的配制：甲醇∶水∶无水乙醇∶三乙胺∶异硫氰酸苯酯=6∶1∶1∶1∶1，现配现用。

1.2.5.2 对照品溶液的衍生化：取对照品溶液50μL吹干，加入100μL 衍生剂，漩涡混匀1 min，在室温下反应15 min 后吹干；进样前用100μL 流动相复溶。

1.2.5.3 供试品溶液的衍生化：取供试品经处理后的上清液50μL 吹干，加入100μL 衍生剂，漩涡混匀1 min，在室温下反应15 min 后吹干，进样前用100μL 流动相复溶。

1.2.5.4 空白的衍生化：直接取100μL 衍生试剂吹干，进样前用流动相100μL 复溶。

1.2.6 专属性试验 将衍生后的对照品溶液、供试品溶液、空白溶液分别进样，在上述色谱条件下分别测定，记录色谱图。

1.2.7 线性试验 分别吸取上述系列标准溶液衍生化后进样20μL 分析，即得一系列色谱数据。以各自的峰面积为纵坐标，以瓜氨酸的系列浓度为横坐标，进行线性分析。

1.2.8 精密度试验 取含瓜氨酸28.54、114.16、570.81μmol·L-l的对照品溶液分别衍生化后进样20μL，每间隔3 h 测定1 次，24 h 内分别进样5 次，计算日内相对标准偏差。按上述方法在1周内连续5 d 进样，计算日间相对标准偏差。

1.2.9 稳定性试验 取含瓜氨酸285.40μmol·L-l的对照品溶液衍生化后进样20μL，24 h 内分别进样6 次，计算相对标准偏差。

1.2.10 重复性试验 取同一份对照品溶液衍生化后连续测定6 次所得峰面积，计算相对标准偏差。

1.2.11 回收率试验 精密吸取已测知含量的空白血浆50μL，分别加入瓜氨酸浓度为28.54、114.16、570.81μmol·L-l的3 种浓度的对照品溶液20μL，加入乙腈置于旋涡混合器上混匀，高速离心后取上清液吹干，加入200μL 衍生剂，混匀后在室温下反应15 min，吹干后用200μL 流动相复溶，每个浓度分别进样3 次，计算得平均回收率。

2 结果

2.1 HPLC 色谱图 由图1 可知，瓜氨酸在22 min左右出峰，样品在此保留时间也出现相同的峰。

2.2 标准曲线 按“1.2.7”条件测定，以瓜氨酸的峰面积为纵坐标，以瓜氨酸浓度为横坐标，绘制瓜氨酸标准曲线。回归方程为Y=2 490.6x-26 068（r=0.999 1，n=3），瓜氨酸在5.71～1 141.62μmol·L-1浓度范围内呈良好的线性关系，最低检测限为0.57μmol·L-1。

2.3 稳定性 取同一份对照品溶液衍生化后24 h内测定6 次所得峰面积的平均值为671 815，RSD为0.95%，稳定性良好。

2.4 重复性 取同一份对照品溶液衍生化后连续测定6 次所得峰面积的平均值为670 817，RSD为0.67%，重复性较好。

2.5 精密度 低、中、高3个浓度对照品溶液衍生后的日间精密度和日内精密度的结果为日间相对平均RSD为0.45%，日内平均RSD为0.98%，总平均RSD<2%，重现性较好。

2.6 回收率 测定样品的平均回收率为99.63%，平均RSD为0.74%。加样回收结果见表1。

表1 加样回收试验

2.7 样品含量测定 取按“1.2.4”项处理的血浆样品，经衍生化后，测得的峰面积带入回归方程，取各时间段的平均值，结果显示家兔模型肠梗阻24 h 后血浆中瓜氨酸含量（n=3）为40.18μmol·L-1，72 h 后血浆中瓜氨酸含量（n=3）为23.21μmol·L-1。

3 讨论

3.1 测定方法的选择 瓜氨酸在体液及组织中的含量水平是多种疾病检测的重要指标。已报道的瓜氨酸检测方法有HPLC 法[5]、薄层扫描法[6]、酶法[7]等。薄层扫描法灵敏度不高，当瓜氨酸浓度低于64.68 mmol·L-1时不能准确检出，故不能用于低浓度的瓜氨酸样品测定。酶作用具有高度专一性，体液物质的酶法测定受到很高的重视，但是由于酶法反应条件难以控制，操作困难，故不宜使用。HPLC法灵敏度高、检测限低，是一种理想的方法。

3.2 衍生试剂的选择 本试验使用柱前衍生法检测瓜氨酸含量，衍生试剂的选择很重要。首先我们选择常用于荧光检测的邻苯二甲醛（OPA）作为衍生试剂[8]，结果发现瓜氨酸标准品的出峰时间及峰面积很不稳定，且峰面积与浓度并不呈线性关系，故放弃此法。有文献报道选用2，4-二硝基氟苯（DNFB）作为衍生剂[9]，DNFB 适用于仲胺的衍生，但衍生后会出现酰亚胺基副产物峰，难以与主峰分离，且DNFB 易发生水解作用，故也淘汰此法。PITC是测定氨基酸常用的衍生试剂，它的特点是在室温下即可反应，从而不必使用水浴，使试验更加容易操作，是一种理想的衍生试剂。

3.3 衍生温度的影响 试验考察了衍生温度为20.0℃、30.0℃、40.0℃对分析效果的影响，随衍生温度的升高，保留时间略延长，峰面积减少，故最终确定最适温度为20.0℃。

3.4 衍生剂量的影响 HPLC 法利用瓜氨酸与衍生化试剂反应生成强紫外吸收的衍生物，在一定波长下测定。因此，衍生剂的用量对瓜氨酸的分离度影响较大。试验考察了不同剂量的衍生剂对分离度的影响，衍生剂用量分别为50、100、150 和200μL。经研究，随着用量的增多，峰面积变化不大，但用量的增多会使成本比较高。另外发现，加入多于150μL的衍生剂后色谱图的峰明显增多，这是因为组织及血浆中含有多种氨基酸，有些氨基酸会和衍生剂发生反应，干扰试验。综合考虑以上因素，以衍生剂的用量为100μL 最宜。

3.5 衍生时间的影响 试验选择不同衍生时间对分离度进行考察，衍生时间分别为5、10、15、20、25 min。结果表明，衍生剂的衍生时间对瓜氨酸的检测有较大影响，时间过长或过短对峰面积的影响都比较大，综合考虑时间、峰面积等因素，选择衍生15 min为最佳衍生时间。

本试验得到了定量检测瓜氨酸的HPLC 方法，并且通过对瓜氨酸的HPLC 分析研究，优化得到了高效液相色谱法测定瓜氨酸的色谱条件。同时，试验也验证了HPLC 法检测瓜氨酸灵敏可靠，分析迅速，准确性高，具有较好的专属性，适用于血药浓度测定和药动学的研究。

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