HPLC波长切换法同时测定桂枝茯苓丸中4种成分

于 艳，张立德，田 原，韩 毅，樊 晖，孙科峰*

(1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳 110032;2.辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110032)

桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁5味中药按等剂量组成［1］，源于汉代名医张仲景的《金匮要略》，具有活血，化瘀，消癥之功［2］。现代药理研究其具有镇静、镇痛、抗炎等作用，能抑制膀胱癌细胞增殖［3］，可治疗宫颈癌［4］，子宫肌瘤［5-6］，子宫内膜异位症［7］，男性精索静脉曲张引起的不育［8］，保护脑缺血再灌注损伤［9］等。对本方中活性成分的定量测定，文献报道多为其中的1种或2种成分的测定［10-12］，本实验采用反相高效液相色谱波长转换法，同时对桂枝茯苓丸中的4种成分即芍药苷、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚进行测定，为该制剂的质量控制提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国Agilent1100高效液相色谱仪，G1379A真空脱气机，G1311A四元梯度泵，G1313A自动进样器，G1315柱恒温箱，G1315B二极管阵列检测器;Agilent B 0403色谱工作站;AE-240电子分析天平;KH-400DB型数控超声波清洗器。

1.2 试药 芍药苷、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚对照品均购自中国药品生物制品检定所，批号分别为110736-201136、 111595-200604、 110710-200212、110708-200505，纯度均为98%以上。桂枝茯苓丸为市售大蜜丸(山西万辉制药有限公司生产，国药准字Z14020065，规格:6 g/丸)。乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)，水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)。流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱，0～10 min(12% ～15%A)，10～15 min(15% ～30%A)。检测波长为230 nm(0～10 min)，290 nm(10～30 min)。体积流量1.0 mL/min。柱温30℃。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚对照品适量，置同一量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含芍药苷 143.25μg、肉桂酸 9.03μg、桂皮醛 7.73μg、丹皮酚25.70μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品剪碎，混匀，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声(功率400 W，频率40 kHz)处理30 min，放冷，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照液的制备 按处方及工艺制备不含桂枝的样品，再按“供试品溶液的制备”项下制备成桂枝阴性对照液。另按处方及工艺制备同时不含赤芍和牡丹皮的样品，再按“供试品溶液的制备”项下制备成赤芍和牡丹皮阴性对照液。

2.5 测定法 分别精密吸取对照品溶液5μL、供试品溶液及阴性对照液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录液相色谱图。由色谱图可知，在与对照品色谱峰相应的位置上供试品具有相同保留时间的色谱峰，阴性对照液在此峰位无吸收，对本品各成分的测定无干扰，见图1。

图1 桂枝茯苓丸HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of Guizhi Fuling Pills

2.6 线性范围考察 分别精密吸取混合对照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μL，注入色谱仪，记录色谱峰面积，进样量X(μg)与峰面积Y经线性回归，得回归方程为:芍药苷Y=1306.1 X+0.7732，r=0.9998;肉桂酸 Y=6394.5 X－3.7989，r=0.9999;桂皮醛 Y=10985.0X－5.7339，r=0.9999;丹皮酚 Y=3029.9 X－10.0610，r=0.9999。芍药苷在0.1433～3.5813μg，肉桂酸在0.0090 ～0.2258μg，桂皮醛在0.0077 ～ 0.1933μg，丹皮酚在0.0257～0.6425μg范围内线性关系良好。

2.7 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液5μL，连续进样6次，结果峰面积值的RSD分别为芍药苷0.29%、肉桂酸0.21%、桂皮醛0.44%、丹皮酚0.34%，表明本仪器精密度较好。

2.8 重复性试验 取本品(批号120110)6份，研细，分别制备成供试品溶液，按测定方法测定，结果平均质量分数分别为芍药苷2.1941 mg/g、肉桂酸0.0271 mg/g、桂皮醛0.4821 mg/g、丹皮酚0.7654 mg/g，RSD分别为芍药苷1.31%、肉桂酸1.98%、桂皮醛0.97%、丹皮酚1.01%，表明本方法重复性良好。

2.9 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号120110)，分别在0、2、4、6、8、10 h测定峰面积，结果峰面积RSD分别为芍药苷0.18%、肉桂酸0.98%、桂皮醛1.24%、丹皮酚2.01%，表明本品溶液10 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取已知含有量的供试品(批号120110)0.25 g，共计6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入混合对照品溶液(含芍药苷0.5450 mg/mL，肉桂酸7.5000μg/mL，桂皮醛0.1180 mg/mL，丹皮酚0.2005 mg/mL)1.0 mL，蒸干溶剂，按“供试品溶液制备”项下制备，进行测定，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率实验结果Tab.1 Results of recovery tests

2.11 样品测定 取本品，按上述方法制备成供试品溶液，精密吸取对照品溶液5μL和供试品溶液20μL，再按本实验选定的色谱条件测定峰面积，用外标一点法计算样品中4种成分的量，结果见表2。

3 讨论

3.1 在供试品溶液的制备过程中，本实验对提取方法、提取溶剂和提取时间进行了考察，分别选用50%甲醇、甲醇和乙醇为提取溶剂，考察了超声提取、加热回流提取及索氏提取3种方法，并对超声提取时间进行了考察，结果以本实验所述方法为最佳供试品制备方法。

表2 样品测定结果(，n=5，mg/丸)Tab.2 Determination results of four constituents(，n=5，mg/pill)

表2 样品测定结果(，n=5，mg/丸)Tab.2 Determination results of four constituents(，n=5，mg/pill)

样品批号 芍药苷 肉桂酸 桂皮醛 丹皮酚120110 13.6458±0.3738 0.1662±0.0036 2.8974±0.0336 4.6824±0.0936120112 13.0416±0.3258 0.1776±0.0036 3.1866±0.0576 4.8966±0.1134120511 13.5372±0.3300 0.1482±0.0030 2.8284±0.0312 4.5024±0.0816120601 13.5714±0.2928 0.1542±0.0042 2.9592±0.0600 5.2260±0.1248120602 13.2348±0.3366 0.1692±0.0030 3.3084±0.0762 5.0274±0.1026

3.2 本方所含赤芍及牡丹皮两味药中均含有芍药苷和丹皮酚［13-15］，在实验过程中也曾分别制备赤芍阴性液和牡丹皮阴性液，结果两药互相干扰，与文献报道一致，因此在考察本制剂的质量时以两药中的总芍药苷和丹皮酚为考察指标。

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