脑络欣通及其拆方对脑缺血再灌注大鼠NGF、PI3K、Akt以及Bad蛋白表达的影响

郜 峦，王 键*，厍 宇，胡建鹏，何 玲，唐 巍

(1.安徽中医药大学，安徽合肥 230038;2.中华中医药学会，北京 100029)

中风病以其高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率的四高特点，成为世界上第二位最常见的死亡原因，也是主要的致残原因［1］。而缺血性卒中最为多见，约占卒中的80%，因此一直得到临床和科研工作者的关注。目前越来越多的研究表明，中医药防治本病正在得到国内外医学界的重视［2］。已有的研究证实，PI3K-Akt信号转导途径，是一条重要的细胞存活信号通路。因此，本研究以PI3K-Akt通路为切入点，在既往工作基础上，继续使用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注动物模型，动态观察新安医家王乐匋教授针对缺血性脑血管病的临床验方脑络欣通及其拆方，对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠NGF、PI3K、Akt以及Bad蛋白的影响，探讨其神经保护机制。

1 材料

1.1 实验动物 健康 SD雄性大鼠120只(安徽医科大学实验动物中心提供)，体质量280～320 g，实验前适应性饲养观察3 d。

1.2 药物与试剂 药物:(1)脑络欣通组为黄芪30 g、川芎10 g、三七10 g、蜈蚣两条等;(2)拆方益气组为黄芪30 g;(3)拆方活血组为川芎10 g、三七10 g、蜈蚣两条等。

试剂:NGF、PI3K、Akt、Bad试剂盒、DAB显色剂等均购自武汉博士德生物科技有限公司。

1.3 主要仪器和设备 日本LKB超薄切片机(日本太阳株式会社产品)，OlympasPM—20型显微照相设备(日本奥林巴斯光学株式会社产品)，日本Olympas BX—51光学显微镜(日本奥林巴斯光学株式会社产品)，电热恒温箱HH.BII.600(上海跃进医疗器械厂)，CHR—Ⅲ双极电凝器(上海Fisher实验器材有限公司)，TB—718自动包埋机(泰维电子设备有限公司)，TK—218I恒温摊片烤片机(泰维电子设备有限公司)，美国Image-proplus专业图像分析软件系统(美国Media Cybernetics公司)。

2 方法

2.1 分组方法 实验动物随机分为模型组、拆方益气组、拆方活血组以及脑络欣通组共4组，每组30只，3、7、14 d 3个不同时间点各10只。

2.2 模型制备方法 参考Longa法制作局灶性脑缺血再灌注动物模型［3-4］。简要模型制作步骤如下:大鼠仰卧固定，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，脱毛、消毒，暴露手术视野，分离颈总、颈外、颈内动脉，电凝颈外动脉的分支(枕动脉、甲状腺上动脉)，结扎颈内动脉的分支翼腭动脉。结扎颈外动脉远心端，用微型动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉，眼科剪在颈外动脉残端作一“V”形切口，插入线栓感觉少许阻力为止(约18～20 mm)，缝合切口。缺血2 h后再灌注时，将线栓轻轻拔出约10 mm。

2.3 给药方法 所有中药药物均购自安徽中医学院第一附属医院，由安徽中医学院中药制剂室制备成汤剂，根据既往药效学给药经验［5］，脑络欣通方、益气方、活血方分别按 8.54、3.5、5.04 g/(kg·d)，早晚各1次灌胃。模型组予以等量生理盐水灌胃。给药时间分别为3、7 d和14 d。

2.4 取材方法 (1)在缺血2 h再灌注3、7、14 d的相应时间位点，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(按0.36 mL/100 g体质量)大鼠。(2)动物打开胸腔，从右心耳部剪口，导管自左心室插至主动脉，注入37℃肝素化生理盐水至右心房流出液变清亮为止，约200 mL左右。(3)注入4%多聚甲醛溶液250 mL进行内固定，灌流30 min。(4)断头取脑，除去小脑和脑干，留存大脑，放入相同的固定液中固定1周。(5)脱水、透明、浸蜡，在视交叉前后连续制作脑部冠状切片。

2.5 指标检测方法 由专业人员按试剂盒说明书，使用免疫组化染色SABC法分别测定NGF、PI3K、Akt以及Bad指标。

2.6 统计学方法 选择大脑中动脉阻塞的同侧额顶叶皮质观察，利用美国Image-proplus专业图像分析软件系统进行图像分析，取平均吸收光密度的平均值。数据结果用()表示，用 SPSS 17.0 for Windows软件分析处理。

3 结果

3.1 不同时间点脑络欣通对PI3K、Akt的影响见表1。

实验结果显示，和模型组比较，脑缺血再灌注损伤发生后，脑络欣通组在脑缺血再灌注3、7、14 d后，能够明显增加PI3K、Akt的表达(P＜0.01或P＜0.001)。在脑缺血再灌注14 d时，活血组PI3K、Akt的表达亦明显增加(P＜0.01或P＜0.001)。组间比较显示，脑缺血再灌注14 d时，脑络欣通组PI3K、Akt的表达显著高于益气组和活血组(P＜0.01)。

3.2 不同时间点脑络欣通对NGF及Bad表达的影响 见表2。

实验结果表明，与模型组比较，3个中药治疗组在再灌注7 d时，NGF表达均有显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。而脑络欣通组在再灌注14 d，NGF表达显著增加(P＜0.01)。缺血再灌注14 d，与模型组相比，拆方活血组和脑络欣通组的Bad蛋白表达均显著降低(P＜0.05)。

表1 不同时间点脑络欣通对PI3K、Akt的影响(，n=10)Tab.1 Influence on expression of PI3K and Akt at different time with Naoluo Xintong Decoction(，n=10)

表1 不同时间点脑络欣通对PI3K、Akt的影响(，n=10)Tab.1 Influence on expression of PI3K and Akt at different time with Naoluo Xintong Decoction(，n=10)

注:与模型组比较，*P＜0.01，＊＊P＜0.001;和脑络欣通组组间比较，#P＜0.01;##P＜0.001

PI3K Akt分组3 d 7 d 14 d 3 d 7 d 14 d模型组 0.51±0.14 0.51±0.14△ 0.57±0.12△0.34±0.04 0.38±0.08 0.38±0.06益气组 0.65±0.25 0.57±0.10 0.57±0.15## 0.38±0.12## 0.40±0.15## 0.46±0.15##活血组 0.72±0.25 0.67±0.32 0.93±0.33*# 0.53±0.12# 0.56±0.15 0.85±0.14＊＊#脑络欣通组 0.78±0.12* 0.87±0.21* 1.00±0.15＊＊ 0.73±0.12* 0.82±0.09＊＊ 1.08±0.13＊＊

表2 不同时间点脑络欣通对NGF及Bad表达的影响(，n=10)Tab.2 Influence on expression of NGF and Bad at different time with Naoluo Xintong Decoction(，n=10)

表2 不同时间点脑络欣通对NGF及Bad表达的影响(，n=10)Tab.2 Influence on expression of NGF and Bad at different time with Naoluo Xintong Decoction(，n=10)

注:和模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

NGF Bad分组3 d 7 d 14 d 3 d 7 d 14 d模型组 0.230±0.004 0.206±0.003 0.234±0.008 0.187±0.034 0.202±0.002 0.282±0.002益气组 0.260±0.003 0.274±0.017* 0.250±0.024 0.176±0.002 0.198±0.017 0.212±0.002活血组 0.230±0.003 0.302±0.009＊＊ 0.245±0.036 0.172±0.003 0.173±0.004 0.183±0.004*脑络欣通组 0.273±0.009 0.301±0.008＊＊ 0.306±0.004＊＊ 0.134±0.004 0.189±0.002 0.181±0.008*

4 讨论

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)作为最初被发现的神经营养因子，是神经系统最重要的生物活性分子之一，能够促进神经元的发育和生存、促进轴突的生长以及突触的重构。现有的研究从临床、实验角度，都表明局灶性脑缺血后NGF的表达增加，有利于受损神经元的修复，在脑缺血损伤过程中发挥作用。中医工作者在研究中也发现，益气活血中药以及针刺的脑保护作用机制也与调节大鼠脑组织NGF表达和保护梗死区神经细胞结构有关［6-7］。其作用机制，近年研究认为，NGF可能通过激活PI3K-Akt信号通路抑制细胞凋亡，发挥脑保护作用。如补阳还五汤可促进脑缺血后脑组织的NGF表达并上调其PI3K/Akt信号转导的表达，调控神经细胞的凋亡，对脑缺血模型大鼠脑组织发挥积极保护作用［8］。

PI3K/Akt信号转导途径是重要的细胞存活信号通路［9］。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidy1inosito1-3 kinase，PI3K)，主要由催化亚基P110和调节亚基P85组成，是一种细胞内蛋白激酶，可被生长因子、细胞因子、激素等细胞外信号刺激激活。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也叫蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是PI3K的主要下游信号分子。活化的Akt通过磷酸化进一步激活或抑制其下游的靶蛋白，进而发挥其调节细胞增殖、分化、迁移及能量代谢等作用［10］。越来越多的研究均证实，中医药通过PI3K/Akt信号通路的激活发挥其神经保护作用［11］，近年来更有学者日渐重视其对神经干细胞增殖、分化的作用［12］。

PI3K/Akt信号途径激活后，可以经由多种途径促进细胞存活，而减少神经细胞凋亡是公认的一个重要环节［13-14］。新近就有实验观察了葛根素的效应机制，认为激活PI3K/Akt信号通路可能是葛根素减少神经细胞凋亡、起到神经保护作用的机制之一［15］。凋亡是一种受相关基因调控的自主性、程序性死亡过程。其中，B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)是研究较多的与凋亡有关的基因。Bad蛋白也是Bcl-2家族中一员，因为可与Bcl-2和Bcl-xL结合形成异源二聚体，具有促进细胞凋亡作用，故名Bad(Bcl-xL/Bcl-2 associated death promoter)［16］。Bad 蛋白在多种细胞中表达，参与细胞凋亡的全过程，其在脑缺血损伤方面的研究日益受到重视［17-18］。研究认为PI3K/Akt通路的保护途径之一就是通过磷酸化Bad，从而减少神经元的凋亡，Bad蛋白有三个磷酸化的部位［19-20］。

“气虚血瘀”是中风病的主要病机特点，气虚为本，血瘀为标。气虚则无力行血而为瘀，瘀血阻滞脑之脉络，上气不足，脑脉气血运行不畅，气血无以濡养，温煦元神，使脑髓失养，神明失用，而致“气虚血瘀”之证。针对这一病机特点，治疗理应益气活血，使气盛而脉络通利。研究中选用的药物脑络欣通，是新安王氏内科代表医家王乐匋教授针对缺血性脑血管病的临床验方，主要由黄芪、川芎、三七、蜈蚣等组成，益气活血、熄风通络，临床疗效显著。在既往的研究中，本课题组已探索建立起稳定、可靠的大鼠脑缺血损伤动物模型制备方法，并从多角度探讨了其多靶点多环节的作用机制。

本次研究在既往研究的基础上，进一步阐明了脑络欣通的神经保护作用机制。研究提示，脑络欣通能够保护脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织，其作用机制可能与促进NGF表达，激活PI3K/Akt通路并降低Bad蛋白表达有关。研究结果表明，脑缺血再灌注损伤发生后，在脑缺血再灌注中晚期，益气活血方药脑络欣通能够明显诱导NGF的表达，进而激活PI3K/Akt细胞存活信号通路，降低下游Bad蛋白的表达，抑制凋亡，从而起到神经保护作用，在部分时段和指标上要优于单纯的益气和活血方，体现了其组方的完备，揭示了其调控PI3K/Akt通路的作用机制，为脑络欣通的临床应用和开发提供了理论依据。

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