5 种食用菌液体发酵菌丝抗氧化活性分析比较

陆武祥，王东华，王秀英，徐艳

(沈阳农业大学 生物科学技术学院，辽宁 沈阳，110161)

氧化应激反应过程中不断产生活性氧，活性氧能对许多生物大分子，比如DNA、蛋白质、脂肪酸产生破环作用，造成其相关结构和细胞功能的损伤［1］。到目前为止，医学界已发现近百种疾病都与自由基有关，尤其是退化性疾病，如动脉粥样硬化、肿瘤、白内障、辐射损伤、烧伤、衰老、关节炎、肺病、肾病与肝病等［2］。而抗氧化剂能捕获并中和自由基，从而去除自由基对人体的损害。从天然植物中提取有效成分研制新型抗氧化剂取得了很好的效果。但是植物受生长环境、气候等方面的限制，资源有限，而且大量砍伐会造成生态环境的破坏。因此，寻找新的天然产物开发抗氧化剂具有重要意义。食用真菌中含有许多对人体有益的活性成分，具有清除自由基、抑菌杀菌及抗辐射等功能。随着现代发酵技术的进步，食用真菌的生产也由田间栽培发展到工业化发酵生产，这样不但可以缩短周期、扩大规模、提高效率、稳定质量，还为解决药源开辟了一条新的途径。研究表明，多种食用真菌液体发酵产物中的蛋白质、氨基酸、核苷类、多糖类及甘露醇等含量远高于天然或人工栽培的大型真菌子实体或菌核［3］。因此，从食用真菌的液体发酵产物中提取有效成分研制新型抗氧化剂不仅价格低廉、来源丰富而且安全天然，是寻找天然抗氧化剂的理想材料。本文比较了几种食用真菌(猴头菇、杏胞菇、香菇、金针菇、鸡腿菇)液体发酵菌丝中多糖和蛋白含量及抗氧化活性，旨在为食用菌液体发酵产物的开发、利用奠定理论基础。

1 材料与仪器

猴头菇(Hericium erinaceus(Bull. )Per. )、杏鲍菇(Pleurotus eryngiiQuel. )、香 菇(Lentinus edodes(Berk. )Sing. )、金针菇(Flammulina velutiper(Fr. )Sing)、鸡腿菇(Copyinds comatus(MUII. Fr)Gray)菌种，购自辽宁省农科院;NBT(氯化硝基四氮唑蓝)，上海恒星应用化学研究所;核黄素，北京奥博星生物技术责任有限公司;1，1-二苯-2-苦肼基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，纯度95%)，A Johnson Matthey Company;其他所用试剂均为国产分析纯。

数字恒温水浴锅，常州国华电器有限公司;低速离心机，北京医用离心机厂;循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司;SL-202 型电子天平，上海长桥精密科学仪器有限公司。超净工作台，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;日光灯反应箱，自制。

2 实验方法

2.1 培养基的配制(g/L)

PDA 固体培养基含马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL。不同菌种的种子培养基与发酵培养基如下:

2.1.1 香菇

种子培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏20 g，KH2PO41 g，MgSO41.5 g。

发酵培养基:玉米粉40 g，酵母膏3 g，蔗糖25 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，VB10.05 g，pH 5.25。

2.1.2 杏鲍菇

种子培养基:马铃薯200 g，麦麸40 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g。

发酵培养基:玉米粉30 g，麦麸20 g，酵母膏3 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g。

2.1.3 金针菇

种子培养基:玉米粉50 g，麦麸30 g，酵母膏10 g，蔗糖4 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，VB10.1 g。

发酵培养基:玉米粉30 g，可溶性淀粉20 g，麦麸30 g，蛋白胨10 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，VB10.1 g。

2.1.4 猴头菇

种子培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏1 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，VB10.1 g，pH6.5。

发酵培养基:可溶性淀粉25 g，酵母膏25 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，VB10.1 g，pH5.0。

2.1.5 鸡腿菇

种子培养基:蔗糖20 g，酵母粉5 g，KH2PO41 g，

MgSO40.05 g，VB10.01 g。

发酵培养基:蔗糖20 g，酵母粉5 g，麦麸40 g，玉米粉30 g，KH2PO43 g，MgSO41 g。

培养基每瓶100 mL 分装于三角瓶中进行高压灭菌，121℃灭菌20 min 后置于超净台冷却备用。

2.2 菌丝的制备

将培养好的种子液按10%的接种量接入发酵培养基中，27 ℃摇床中培养，待菌丝生长成熟后将其过滤，水洗后低温烘干备用。

2.3 菌丝多糖及蛋白的提取

2.3.1 菌丝多糖的提取

将收集的菌丝干燥后研磨成粉末，取菌丝粉末各2 g 于试管中，加水20 mL，水浴加热1 h 后，离心取上清液。

2.3.2 菌丝蛋白的提取

将收集的菌丝干燥后研磨成粉末，取菌丝粉末各2 g 于烧杯中，加水20 mL，冻融24 h，离心取上清液。

2.4 菌丝多糖及蛋白的含量测定

2.4.1 菌丝多糖含量的测定

多糖的含量测定:采用苯酚－硫酸法。

葡萄糖标准曲线:将20 mg 葡萄糖溶解并定容至500 mL。分别量取母液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，定容至10 mL，各量取1 mL 溶液、1 mL 6%苯酚、5 mL 浓H2SO4摇匀放置10 min，沸水浴加热15 min，冷却至室温，在490 nm 波长处测定吸光度值。以含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

菌丝多糖含量测定:分别量取不同体积的各种菌丝多糖母液装入具塞试管中，配制成浓度梯度。然后再从试管中分别量取1 mL 溶液装入小试管中，并依次加入1 mL 6%苯酚溶液，5 mL 浓H2SO4，摇匀放置10 min，沸水浴加热15 min，冷却至室温，在490 nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算出不同菌丝中多糖含量。

2.4.2 菌丝蛋白含量的测定

蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。

蛋白标准曲线:取牛血清白蛋白，配制成浓度为1 mg/mL，用蒸馏水分别稀释成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL。准确吸取各溶液0.1 mL，分别放入具塞试管中，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，混匀，放置2 min 后，在595 nm 处测定吸光度值。

菌丝蛋白含量测定:分别量取不同体积的各种菌丝蛋白母液装入具塞试管中，配制成浓度梯度。分别量取上述溶液0.1 mL 置于20 mL 具塞试管中，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，混匀，放置2 min 后，在595 nm 处测定吸光度值。

2.5 菌丝抗氧化活性的体外测定

将各菌丝多糖和蛋白分别定容至25 mL，取各溶液分别进行如下抗氧化活性的测定。

2.5.1 清除超氧自由基活性的测定［4］

采用光照核黄素体系产生超氧自由基。用0.05 mol/L pH 7.4 的磷酸盐缓冲液为溶剂，配制1.67 ×10－5mol/L 核黄素，0.01 mol/L 蛋氨酸，4.6 ×10－5mol/L 氯化硝基四氮唑兰(NBT)。分别取上述3 种溶液各2.0 mL，加入不同浓度的样品溶液1.0 mL，空白管以1.0 mL 缓冲液代替样品溶液。置于光照箱中光照20 min，取出后以缓冲溶液为参比于560 nm 处测定溶液的吸光度。清除率按下式计算。A0为空白管的吸光度，A样为样品管的吸光度。

清除率公式:

2.5.2 清除羟自由基活性的测定［5］

取各样品液1 mL，加入12 mmol/L 水杨酸钠0.5 mL，0.9 mol/L FeSO40.5 mL，最后加18 mmol/L H2O21 mL 启动反应，37 ℃恒温水浴反应1 h 后5 000 r/min 离心10 min，取上清液并稀释至10 mL，在510 nm 分光光度计上测吸光值A，根据以下公式计算·OH 的清除率。

式中:A为不加样品时体系的吸光值;A1为加入样品后体系的吸光值;A2为样品的本底吸光值。

2.5.3 清除DPPH·活性的测定［6］

采用提取物与稳定自由基DPPH·反应的分析方法。在同一具塞试管中加入2 mL DPPH 溶液(2 ×10－4mol/L)，1 mL 不同浓度样品溶液，摇匀，室温避光静止30 min，用无水乙醇作参比在517 nm 处测定吸光度A 样品。用1 mL 蒸馏水代替样液，测定空白吸光度A 空白。用2 mL 无水乙醇代替DPPH，测定吸光度值A 对照。样品对DPPH·的清除率计算:

2.5.4 还原力的测定［7］

本研究采用铁离子还原法(FRAP)和铁氰化钾还原法来测定各样品的还原力。具体方法:分别取2.5 mL 不同浓度的样品于试管中，依次加入2.5 mL 0.2 moL/L pH 6.6 的磷酸盐缓冲液和2.5 mL 1% K3［Fe(CN)6］于50 ℃水浴保温20 min 后，快速冷却，再加入2.5 mL 10% TCA，以4 000 r/min 离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL 重蒸水，0.5 mL 0.1%FeCl3，充分混匀，静止10 min，以蒸馏水为对照在700 nm 处测定吸光度值。

2.6 抗氧化活性综合评价分析法［8］

由于不同抗氧化活性测定方法测得的各个菌丝多糖、蛋白抗氧化活性各不相同。为了对5 种食用菌菌丝抗氧化活性进行系统的综合评价，采用综合评价法对5 种菌丝多糖、蛋白的清除超氧阴离子自由基(O2－)、羟自由基(·OH)、DPPH 自由基、还原力进行综合评价。综合评价法是将多个指标转化为一个能够反映综合情况的指标来进行评价，先分别按不同指标的评价标准对各评价指标进行评分，然后采用加权相加，求得总分，利用数字进行比较更直观、具体、可靠。根据极值标准化公式Zij=(Xij－Xijmin)/(Xijmax－Xijmin)，其中，Xij为第i个菌种第j个抗氧化方法指标值。Xijmax、Xijmin分别为第i个菌种第j个抗氧化方法指标的最大值和最小值。

3 结果与分析

3.1 各种菌丝多糖含量及抗氧化活性的测定

表1 不同菌丝多糖含量及抗氧化活性的测定结果Table 1 The determination results of the content and antioxidation activity of different mycelium polysaccharides

5 种菌丝多糖抗氧化活性的测定结果见表1。由表l 可知，除鸡腿菇菌丝多糖抗氧化能力较弱外，其他菌丝多糖均具有较强的抗氧化能力，但不同多糖对不同自由基的清除作用是不同的。5 种菌丝多糖含量顺序为:金针菇＞猴头菇＞杏胞菇＞香菇＞鸡腿菇。5 种菌丝多糖超氧阴离子自由基清除率顺序为:猴头菇＞金针菇＞香菇＞杏胞菇＞鸡腿菇。5 种菌丝多糖羟自由基清除率顺序为:金针菇＞猴头菇＞杏胞菇＞香菇＞鸡腿菇。5 种菌丝多糖DPPH 自由基清除率顺序为:金针菇＞杏胞菇＞香菇＞猴头菇＞鸡腿菇。5 种菌丝多糖还原力顺序为:金针菇＞猴头菇＞杏胞菇＞香菇＞鸡腿菇。综合评价法结果表明，5种食用菌菌丝多糖中，金针菇菌丝多糖的抗氧化活性最高。

3.2 各种菌丝蛋白含量及抗氧化活性的测定

5 种菌丝蛋白含量及抗氧化活性的测定结果见表2。由表2 可知，5 种菌丝蛋白水溶液均有一定抗氧化作用，但不同蛋白对不同自由基的清除作用不同，菌丝蛋白含量顺序为:猴头菇＞金针菇＞杏胞菇＞香菇＞鸡腿菇;菌丝蛋白超氧阴离子自由基清除率顺序为:金针菇＞猴头菇＞杏胞菇＞香菇＞鸡腿菇;菌丝蛋白羟自由基清除率顺序为:杏胞菇＞猴头菇＞金针菇＞鸡腿菇＞香菇;菌丝蛋白DPPH 自由基清除率顺序为:金针菇＞猴头菇＞香菇＞杏胞菇＞鸡腿菇;菌丝蛋白还原力顺序为:猴头菇＞杏胞菇＞香菇＞金针菇＞鸡腿菇。综合评价结果表明，5 种食用菌菌丝蛋白中，猴头菇菌丝蛋白的抗氧化活性最高。

表2 不同菌丝蛋白含量及抗氧化活性的测定结果Table 2 The determination results of the content and antioxidation activity of different mycelium proteins

5 种食用菌菌丝多糖和蛋白抗氧化活性的测定结果显示不同菌丝多糖和蛋白抗氧化活性不同，表明不同食用菌中含有的多糖和蛋白不同，以致抗氧化能力不同。同一种食用菌菌丝多糖和蛋白对不同自由基的清除能力各不相同，这可能是因为同一种食用菌菌丝中存在多种多糖或蛋白，不同多糖或蛋白结合不同自由基的能力不同，表明食用菌含有多种抗氧化活性物质，但具体起抗氧化作用的物质还需进一步分离鉴定。不同菌丝中多糖或蛋白含量不同，菌丝中多糖或蛋白含量越高，综合抗氧化活性越强。

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