肠炎沙门氏菌在鲜切果蔬中的动态生长变化*
2013-10-30罗婵陈安均崔慧玲蒲彪敖晓琳
罗婵,陈安均,崔慧玲,蒲彪,敖晓琳
(四川农业大学 食品学院,四川 雅安,625014)
鲜切果蔬通常被消费者认为是较为安全的食品,但由于缺少更多的加工处理,因此也存在潜在的安全问题[1]。随着鲜切果蔬消费量逐年增加,因食用新鲜果蔬及鲜切果蔬而引起的食源性疾病的爆发也愈加频繁[2]。1996 年到2008 年期间,美国有82 起食源性疾病的爆发与食用鲜切产品有关,其中34%与消费绿叶类蔬菜有关,引起949 人患病,5 人死亡[3]。农田灌溉、清洗用水、动物、用城市污水制作的肥料、带菌的工人及不卫生食品生产设备都是病原菌污染的来源,与鲜切果蔬相关的病原菌主要包括Escherichia coliO157:H7,Listeria monocytogenes和Salmonella[4]。
沙门菌属(Salmonellaspp. )是与食源性疾病发作有关的最常见的病原菌,最初常见于家禽产品中,现也与鲜切产品相联系。1998 -2002 年,美国爆发的食源性疾病事件中,有13.1%是由沙门菌属引起的[5],在我国,1994 -2003 年间,766 起细菌性食物中毒事件中沙门氏菌发生132 起,排名第2;中毒人数比例最大,为20.4%(8928 人),在132 起事件中,以肠炎沙门氏菌所占比例最大,为26.5%[6]。英国的一项调查表明,肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌感染占到人类沙门氏菌感染病例的75%以上[7]。一系列被沙门菌感染的果蔬中,最常见的是生菜、发芽的种子、瓜类(如西瓜和甜瓜)和马铃薯。从原料供应到最终产品,沙门氏菌常从生菜、花椰菜、芽菜、芥菜苗、莴苣、菠菜、蘑菇、豆芽、苜蓿、未经高温杀菌的果汁和新鲜果蔬沙拉中分离出来[8]。
本试验以苹果、卷心菜、生菜为原料,研究了肠炎沙门氏菌在3 种鲜切果蔬中的生长情况,并考察4 种不同温度(4、10、15、30℃)对肠炎沙门氏菌生长的影响,以期对GP 模型的预测准确性进行验证,从而为控制鲜切果蔬中致病菌的生长提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料及菌株
生菜、卷心菜、苹果均购于当地农贸市场,运回实验室后放置于4℃冰箱备用;肠炎沙门氏菌标准菌株CICC21482,四川农业大学食品学院微生物实验室馈赠。
1.1.2 培养基及主要仪器
亚硫酸铋(BS)培养基,蛋白胨;HR40-ⅡA2 生物安全柜,青岛海尔特种电器有限公司;SYQ-DSX-280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;DNP-9126 型恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司。
1.2 样品处理及接种
1.2.1 样品的准备
生菜、卷心菜弃去外层受损叶片,流动自来水冲去叶片上的泥土,用锋利的小刀切成3 cm ×0.5 cm(长×宽)左右的条,苹果去皮后,切成1 cm3左右的小丁,置于50 mg/L 的ClO2溶液中杀菌2 min,无菌蒸馏水漂洗,捞出于无菌超净工作台中自然晾干。无菌操作,称取10g 样品于保鲜袋中,备用。
1.2.2 接种液准备
挑取肠炎沙门氏菌斜面培养物接种于10mL 无菌营养肉汤中,37℃培养14 h 后冷冻离心(5000 ×g,10 min),弃上清液,加入10 mL 无菌营养肉汤,制成菌悬液,用无菌肉汤适当稀释,获得菌量约103~104CFU/mL 的接种液,接种液中SE 的数量通过涂布平板计数获得。
1.2.3 样品接种
采用点植法[9],用移液器取0.1 mL 接种液,均匀接种在保鲜袋中的10 g 样品中,大约15 个点左右,置于生物安全柜中自然晾干2h,使接种液中的SE 充分附着在样品上。
1.2.4 处理
将接种好样品的保鲜袋分别置于4、10、15、30℃条件下保藏7 d,定时取样,4、10℃每12 h 取样,15℃前2 d 每12 h 取样,后5 d 每24 h 取样,30℃第1 天每4 h 取样,后6 d 每24 h 取1 次样。
1.2.5 肠炎沙门氏菌的计数
取出保鲜袋后,无菌加入90 mL 无菌BPW 缓冲蛋白胨水,拍打2 min 后,无菌生理盐水梯度稀释,选择合适的梯度稀释液0.1 mL 涂布BS 培养基,待培养基充分吸收菌液后,放至37℃培养箱中培养48 h,然后计算SE 的数量。
1.2.6 应用的模型
应用ComBase 数据库中的生长预测模型GP 预测SE 的生长,DMFit 软件拟合SE 在3 种鲜切果蔬中各温度下生长的观察值,GP 是基于Baranyi 和Roberts 模型的预测模型,Baranyi 和Roberts 模型的表述为:
式中:N为t时微生物数量;N0为0 时微生物数量;Nmin为最小微生物数量;Kmax为最大相对死亡率;r,s为参数[10]。
1.2.7 模型可靠性评价
采用修正决定系数(Adjusted R Square,R2Adj)来评价模型的拟合度,R2Adj越接近1,表示预测模型对实验数据拟合度越高。R2Adj用下式表示:
式中:R2为决定系数;N代表预测模型中变量参数的个数;n为试验次数。
采用均方根误差(Root Mean Square Error,RMSE)、准确因子(Accuracy factor,Af)和偏差因子(Bias factor,Bf)来评价已建立的SE 动力学预测模型的可靠性[11]。RMSE 越小,表示模型预测值的离散程度越小;Af越接近1,模型的准确度越高;Bf小于1表明,其预测的SE 在鲜切果蔬中的生长比实际生长速度慢。RMSE、准确因子和偏差因子用下式表示:
式中,Nobs是试验实际测得的SE 数量;Npre是应用模型预测得到的与Nobs同一时间的SE 数量;n是试验次数。
2 结果与分析
2.1 不同温度下SE 在鲜切苹果中的生长情况
鲜切苹果中SE 的最初接种量在3.4 ~3.7log(CFU/g)之间。如图1 中实际观测值可见,4℃条件下,SE 的生长基本受到抑制,并有下降的趋势;30℃下SE 在48h 内生长迅速,最先生长到最大菌落数6.74log(CFU/g),依次是15℃、10℃,但后两者均未达到30℃条件下的最大菌落数。同时,30℃在48h后最先减少,稳定期的时间也短于其他两种温度,当细菌数量减少到一定数量时,其在鲜切苹果中的数量基本趋于稳定,约在4.0 ~5.0log(CFU/g)之间。
用DMFit 软件拟合SE 在不同温度下的生长曲线,拟合的曲线由图1 中的实线表示,结果见表1,10、15、30℃温度下的拟合度较好,R2Adj分别是0.97、0.92、0.95,均高于4℃的0.72。从最大生长速率可以看出,4℃下156h 内,SE 在鲜切苹果中最大生长速率为负值,在剩余3 种温度下,最大生长速率从大到小依次为30、15、10℃。用GP 预测SE 在肉汤培养基中的生长状况,预测的生长曲线见图1 中的虚线,SE在肉汤培养基的生长明显不同于在鲜切苹果中的生长,GP 对10、15℃的预测偏低,对30℃的预测则偏高。除4℃外,其在10、15、30℃3 种温度下生长的最大菌落数均不能达到GP 所预测的最大值。
表1 DMFit 软件对不同温度下SE 在鲜切苹果中的拟合结果Table 1 Results are fitted by DMFit software of SE in fresh-cut apple at different temperatures
2.2 不同温度下SE 在鲜切卷心菜中的生长情况
鲜切卷心菜中SE 的最初接种量在3.1 ~3.7log(CFU/g)之间。如图2 中实际观测值可见,4℃下基本受到抑制;10、15、30℃下SE 分别在72、48、48h 生长到最大菌落数6.61、6.54、6.69log(CFU/g)。10℃在108h 后菌数开始减少,而15、30℃在达到最大菌落数后的数量基本趋于稳定,约在5.8 ~6.0log(CFU/g)之间。
DMFit 软件拟合的曲线由图2 中的实线表示,其结果见表2,4、10、15、30℃下R2Adj分别是0.81、0.98、0.90、0.90,4℃下156h 内,SE 最大生长速率为负值,而在其余3 种温度下,最大生长速率从大到小依次为30、15、10℃。用GP 预测其生长曲线见图2 中的虚线,GP 对10℃的预测偏低,对30℃的预测则偏高。
图1 不同温度下SE 在鲜切苹果中的生长特征与GP 预测曲线Fig.1 Growth characteristics and predictive curves by GP of SE in fresh-cut apple at different temperatures
图2 不同温度下SE 在鲜切卷心菜中的生长特征与GP 预测曲线Fig.2 Growth characteristics and predictive curves by GP of SE in fresh-cut cabbage at different temperatures
表2 DMFit 软件对不同温度下SE 在鲜切卷心菜中的拟合结果Table 2 Results are fitted by DMFit software of SE in fresh-cut cabbage at different temperatures
2.3 不同温度下SE 在鲜切生菜中的生长情况
鲜切生菜中SE 最初接种量在3.4 ~3.7log(CFU/g)之间。如图3 中实际观测值可见,4℃下基本受到抑制;10℃、15℃、30℃下SE 分别在48、48、24 h 进入稳定期。10℃达到最大菌落数后的数量基本趋于稳定,15、30℃在进入稳定期后数量就开始减少。
DMFit 软件拟合的曲线由图3 中的实线表示,其结果见表3,4、10、15、30℃下R2Adj分别是0.92、0.99、0.95、0.94,4℃下156h 内,SE 最大生长速率为负值,而在其余3 种温度下,最大生长速率从大到小依次为30、15、10℃。用GP 预测其生长曲线见图3 中的虚线,GP 对10℃的预测偏低,对30℃的预测则偏高。
图3 不同温度下SE 在鲜切生菜中的生长特征与GP 预测曲线Fig.3 Growth characteristics and predictive curves by GP of SE in fresh-cut lettuce at different temperatures
表3 DMFit 软件对不同温度下SE 在鲜切生菜中的拟合结果Tab.3 Results are fitted by DMFit software of SE in fresh-cut lettuce at different temperatures
2.4 预测值相对于实测值的Af及Bf
GP 模型的预测值与DMFit 软件拟合的实测值的准确因子(Af)及偏差因子(Bf)见表4。
表4 GP 模型的预测值相对于实测值的Af及BfTab.4 Accuracy and bias factors of GP model compared with observations
3 结论与讨论
肠炎沙门氏菌可以在10、15、30℃的鲜切苹果、卷心菜、生菜中迅速生长,并且可以在4℃下存活,但是SE 在鲜切果蔬中的最大菌落数均不能达到GP 中的预测值,这与GP 模型的建立是基于肉汤液体培养基有关,当以食品为介质时,其预测存在一定的偏差[12]。本研究采用向原料食品中接种特定微生物来获得数据建立模型,这种方法可以考察食品原料组织对特定微生物生长的影响,所建模型能更好预测特定微生物在实际食品中的生长[13]。苹果、生菜切割后于30℃保存后的第2d 就开始腐败,腐败菌的大量生长及营养物质的消耗也会影响沙门氏菌的生长,同时,沙门氏菌对鲜切果蔬中本身存在的微生物如乳酸菌、肠杆菌也有显著的敏感性[14],使之不能达到理论的最大菌落数,也没有达到4.0log(CFU/g)的增量,这结果与Vandamn[15]在22℃鲜切芹菜及Zhuang[16]在30℃土豆中的研究一致。但也有研究表明,沙门氏菌在25℃的鲜切桃中可生长到8.0log(CFU/g)[17],其数量却在25℃的苜蓿芽中有所下降,这与苜蓿芽的蜡状角质层有关[18]。
鲜切果蔬的内在因素(如果蔬本身的pH、营养物质组成等)及所处的外部环境均会影响致病菌的生长[19],因此,SE 在不同的鲜切果蔬中的生长存在一定的差异,但是,影响其生长的最主要因素还是温度及pH。本研究中,4℃可显著抑制SE 在鲜切苹果、卷心菜、生菜上的生长,这与Kakiomenou 等[20]的研究结果一致。在10、15、30℃下SE 的生长曲线相似,但生长速度不同,温度越高,生长速度越快,最大菌落数越大。pH 已与温度一同被认为是新鲜果蔬中影响微生物生长的决定性因素,但是,即便是酸性较高的产品(如苹果),致病菌也可在其上生长,甚至在10℃或以上温度时以指数方式生长[21]。但也有研究表明沙门氏菌不能在pH 低于4.0 的环境中有规律地生长[22],如24℃下pH3.6 ~3.8 的鲜切草莓,其原因可能是与果蔬中有机酸的种类有关[23]。
本试验用DMFit 软件对3 种鲜切果蔬中SE 在4种温度下生长状况进行拟合,DMFit 是基于Baranyi和Roberts 模型的拟合软件,Baranyi 和Roberts 模型能够在温度波动条件下获得较为理想的预测效果[24],本试验中,DMFit 只能拟合SE 在鲜切果蔬中生长的前段时间,拟合结果显示4 种温度下的拟合曲线均没有延滞期。GP 模型对SE 的生长预测温度范围为7 ~40℃,因此,本研究中没有对4℃下的Af及Bf进行讨论,其余温度下三种鲜切果蔬的预测值相对于实测值的Af在1.10 ~1.48 之间,Bf在0.82 ~1.48 之间,而Ross 曾提出,Af小于1.15,Bf介于0.9 ~1.05间可作为一个好的预测模型的判定标准,二者数值接近1,表示预测模型的可靠程度越高[12]。由此可见,本研究中GP 模型预测在一定程度上与实测值存在一定的差异。
本试验研究了肠炎沙门氏菌在不同温度下鲜切果蔬中的存活及生长,为确保鲜切果蔬的安全,可选择4℃的冷藏温度作为鲜切果蔬保存温度,虽然GP模型对SE 的预测有一定的偏差,但在没有更好的预测模型之前,GP 的预测仍具有参考价值,只是在安全风险评估中要考虑预测的误差。同时,在果蔬采后及加工中运用良好农业规范(GAP)、良好操作规范(GMP)及危害分析和关键控制点(HACCP)等方法也是十分必要的。
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