小鼠骨片间充质干细胞分离培养及鉴定

马予洁 陈 津 黄梁浒 王庆华 郭子宽 谭建明

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是再生医学重要的种子细胞，在许多疾病治疗中呈现出令人振奋的治疗效果。MSC首先是由Friedenstein等[1-2]从骨髓中利用其贴壁生长的特性成功分离出来。这种方法后来被许多研究者用来分离人和实验动物来源的骨髓MSC[3-6]。小鼠是用量最大、用途最广、品种最多的实验动物，已广泛应用于生物医学各领域的科学实验。然而令人烦恼的是实验者很难成功的从小鼠骨髓分离到高纯度的MSC，或者很难实现MSC的连续多次体外传代扩增培养[7]。究其原因，是因为小鼠骨髓量很少，MSC含量极少，同时混有大量造血细胞的优势生长，严重影响了MSC的分离培养[7]。研究发现，MSC存在于许多组织中[8]，本研究将尝试从小鼠骨片中分离MSC，并建立其分离培养的方法。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：C57BL/6小鼠购自军事医学科学院动物实验中心，雄性，7 d龄。所有实验在符合动物实验伦理要求下进行。

2.主要试剂及仪器：αMEM基础培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Stem cell公司），D-60 mm细胞培养皿（美国Costar公司），0.2﹪胶原酶、β甘油磷酸钠、地塞米松、胰岛素、1-甲基-3异丁基-黄嘌呤、吲哚美辛、维生素C、油红O（美国Sigma），碱性磷酸酶染色试剂盒（美国Sigma），胰蛋白酶（美国 Amresco公司），PE、FITC或PERCP标记抗小鼠单克隆抗体CD29，CD34，CD45，CD90，Scal1（美国 BD 公司），CO2培养箱（美国Thermo公司），眼科镊，眼科剪。

二、方法

1.小鼠骨片MSC分离培养：C57小鼠经脱颈处死后，75﹪酒精浸泡消毒10 min。用眼科剪横向剪开皮肤和肌肉，用眼科镊拨开露出小鼠胫骨和股骨，剥离胫骨和股骨，从胫骨头和股骨头处剪断，放入预先放有培养基的培养皿中。用1 ml注射器吸取基础培养基反复冲洗骨髓腔内的骨髓直至骨片呈白色。将骨片剪碎，加入胶原酶Ⅰ（2 mg/ml）2 ml，37℃消化 1～2 h，加入胎牛血清终止消化。加入αMEM洗涤骨片，将骨片转移到新的培养皿中，加入新鲜配制的含胎牛血清10﹪（v/v）和双抗0.1﹪（v/v）的完全培养基，37℃、5﹪CO2培养箱培养3～4 d。加入0.25﹪胰酶消化3 min，收获MSC，按1:3传代培养，每2～3 d更换培养基1次。残留的骨片可继续培养获得更多的原代MSC。收获P2，P3代细胞进行实验研究。

2.流式鉴定：收获P2代小鼠MSC，经PBS洗涤2次，加入PE、FITC或PERCP标记抗小鼠CD29，CD34，CD45，CD90，Scal1单克隆抗体避光孵育30 min，加入PBS洗涤2次，1500 rpm离心5 min，重悬细胞，进行流式测定。FlowJ 7.6软件进行数据分析。

3.成骨诱导分化及鉴定：取P3代小鼠MSC，以每孔2×104细胞数种植于24孔板中，60﹪～ 70﹪融合时，更换为成骨诱导培养基，含胎牛血清10﹪（v/v），β甘油磷酸钠10 mmol/L，地塞米松10-7mol/L，维生素C 50 μmol/L。每3～4 d更换培养基1次，诱导2～3周后进行碱性磷酸酶染色鉴定。步骤为吸弃培养基，4﹪多聚甲醛固定30 min，去离子水洗涤2次，加入ALP染料混合液，室温孵育30 min，去离子水洗涤2次，每次2 min，加入苏木素复染10 min，去离子水洗涤，倒置相差显微镜下观察。

4.成脂诱导分化及鉴定：取P3代小鼠MSC，以每孔2×104细胞数种植于24孔板中，60﹪～ 70﹪融合时，更换含胎牛血清10﹪（v/v），地塞米松10-6mol/L，胰岛素10 ng/ml，1-甲基-3异丁基-黄嘌呤0.5 μmol/L，吲哚美辛10-4mol/L的成脂诱导培养基，每3～4 d更换培养基1次，2周后进行油红O染色鉴定成脂细胞。步骤为吸弃培养基，PBS洗涤1次，加入4﹪多聚甲醛固定30 min，70﹪异丙醇洗涤2次，加入2﹪油红O室温下染色10～15 min，弃去油红O染料，异丙醇洗涤残留油红O，倒置显微镜下观察细胞内脂滴。

结 果

1.小鼠骨片分离清洗：小鼠胫骨和股骨较小，约牙签大小，可见骨腔内红色骨髓（图1a），用 1 ml注射器吸取 αMEM培养基冲洗髓腔骨髓后，颜色变白（图1b）。

2.小鼠骨片MSC原代培养：小鼠骨片培养2 d后就可以看见骨片边缘爬出长梭形细胞，3 d后爬出细胞越来越多，并成集落样生长（图2）。消化细胞进行传代后，可获得纯度较高的MSC，并且细胞增殖速度较快，3 d就可达到90﹪融合。获得的MSC可以连续传代数代，仍然保持良好的细胞形态和增殖能力（图3）。残留的骨片还可以继续作为原代MSC的来源继续培养，经过数次培养后，骨片逐渐疏松，除MSC外，残留骨细胞（图4）。

3.流式鉴定结果：流式细胞仪结果显示，获得的细胞表达Scal1（92.7﹪），CD29（98.4﹪），CD90（91.6﹪）等MSC标志物，不表达CD34（1.57﹪），CD45（3.99﹪），CD11b（0.63﹪）等造血细胞标志物（图5）。符合小鼠MSC的标准。

图1 小鼠骨片分离

图2 倒置相差显微镜下观察小鼠骨片MSC原代培养（×100）

图3 倒置相差显微镜下观察小鼠骨片MSC传代培养（×100）

4.向成骨细胞诱导分化结果：小鼠骨片MSC经成骨诱导培养基诱导2周后，经碱性磷酸酶（ALP）染色提示细胞内有大量酶颗粒形成，与成骨细胞活性相关的碱性磷酸酶表达阳性（图6）。说明获得的细胞可以成功的诱导分化成骨细胞。

5.向脂肪细胞诱导分化结果：获得的细胞经成脂诱导培养基诱导4～5 d后，倒置相差显微镜观察可见胞浆内出现圆形脂滴，并且随着诱导时间的延长，脂滴逐渐增多增大。诱导2周后，可见大多数细胞内充满脂滴。经脂肪细胞特异性油红O染色，呈红色油滴样（图7）。证实获得的细胞可以成功诱导成脂肪细胞。

图4 倒置相差显微镜下观察残留骨片培养（×100）

图5 小鼠骨片MSC表面标志流式检测结果

图6 倒置相差显微镜下观察小鼠骨片MSC向成骨细胞诱导分化结果(ALP染色×100)

图7 倒置相差显微镜下观察成脂诱导结果（油红O染色×100）

讨 论

MSC因其具有分化潜能、免疫调控、分泌细胞因子等功能成为再生医学重要的种子细胞之一。目前已经被广泛用于多种疾病治疗的实验研究，包括移植物抗宿主病、糖尿病、脊髓损伤、肺和关节疾病等[9]。小鼠因其品系纯，应用于科学研究中所获的实验结果敏感性高，一致性强，重复性高等优点，已被广泛应用于生物学、医学、兽医学、生理学、遗传学、胚胎发生学等领域的科学实验。小鼠还具有容易实现基因敲除[10]、体积小、繁殖快、经济等优点，作为动物模型越来越受到研究者的重视[11]。研究者已经采用小鼠成功制作许多人类疾病的动物模型如糖尿病、卵巢癌、肥胖、白内障、创伤、甚至HIV模型[12]等，为开展干细胞治疗疾病的实验研究提供了重要基础[11，13-15]。然而研究者在采用传统方法分离小鼠骨髓MSC时却遇到了难题，很难成功的分离高纯度的MSC，或者很难实现在体外长时间继代培养[7]。一些研究者采用大鼠或人源的MSC作为供者细胞，替代小鼠来源MSC来研究治疗效果，以解决小鼠MSC来源不足的问题。虽然MSC的免疫原性很低，但依然不能排除异种来源细胞对实验研究效果的影响。为避免上述问题对实验研究的影响，建立能获得足量、稳定的小鼠来源MSC对研究者具有重要意义。

MSC是骨髓腔中的基质细胞，是构成骨髓造血微环境的重要成分，因此骨实质中可能存在大量的MSC[16]。研究发现，在骨髓腔边缘或骨实质中还存在更原始的MSC，表达成熟MSC不表达神经干细胞的标志[16]。本研究通过清洗骨髓腔内骨髓，去除造血细胞的影响，成功从小鼠骨片中分离出高纯度的MSC，并成功进行体外传代培养。获得的细胞高表达MSC标志Scal1，CD29，CD90，不表达造血系统细胞标志物CD11b，CD34，CD45。并具有多向分化的能力，可以成功诱导成脂肪细胞、骨细胞。

所以通过骨片法可以获得小鼠来源MSC，并且纯度高，增殖能力更强，能够实现在体外较长时间的继代培养，为实验研究提供了很好的种子来源。同时还可以利用许多转基因小鼠如绿色荧光小鼠等，分离获得具有特殊功能的MSC（表达绿色荧光），以及利用一些基因敲除小鼠获得某基因缺失的特殊MSC，为进一步开展实验研究提供更丰富的种子来源。

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