基于树突状细胞的肿瘤疫苗研究进展

吉海杰 王黎明 刘洋 史高娜 李会 刘大庆 李娜 刘丽敏 裴雪涛 吴明远

1973年，Steinman和Cohn[1]在小鼠脾脏发现具有树枝状突起的独特形态细胞，并将之命名为树突状细胞（dendritic cell，DC）。DC作为连接先天性免疫和获得性免疫的桥梁，是机体识别和摄取病原体和肿瘤抗原的关键细胞，具有抗原提呈能力强和激活初始型T细胞的特点。机体通过DC提呈抗原信息给T淋巴细胞并将其激活而获得特异性免疫应答，因此DC参与多种疾病如感染、肿瘤、过敏及移植排斥的发生与发展。由于发现DC及其在获得性免疫应答中的作用，Steinman荣获2011年诺贝尔生理或医学奖并被誉为DC之父[2]。

随着肿瘤免疫学的发展，DC作为肿瘤治疗手段受到了越来越多的关注并被寄予厚望。研究发现肿瘤抗原致敏DC再回输机体能刺激宿主免疫系统产生抗肿瘤免疫应答，因此负载肿瘤抗原的DC疫苗被认为是最具潜能的一种肿瘤免疫治疗手段[3-4]。2010年4月美国FDA批准了首个自体免疫细胞治疗药物Sipuleucel-T用于前列腺癌的治疗[5]，标志着全球首个DC肿瘤疫苗成功用于临床，为其他肿瘤疫苗的研究提供了借鉴。本文主要对DC扩增体系、肿瘤抗原、DC疫苗制备方法及DC疫苗抗肿瘤临床研究的最新进展作一综述。

一、DC扩增体系研究

DC在组织中分布很广，但数量极少，人外周血中的DC不足白细胞数量的1﹪[6]，由于采集困难不能满足临床研究的需要，因此利用DC的前体细胞体外扩增诱导分化是研究DC肿瘤疫苗的必要途径。细胞因子是DC体外扩增培养不可或缺的物质，主要有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、白细胞介素（IL-4）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、干细胞生长因子（SCF）及Flt3配体（FL）等。骨髓、外周血和脐带血来源的单核细胞在体外采用多种细胞因子进行序贯诱导培养收获DC，不同细胞因子发挥不同作用。研究表明GM-CSF能促进髓系细胞发育，是维持DC发育和分化最根本的细胞因子，通过诱导单核细胞表达CD116分化为DC[7]。IL-4可抑制巨噬细胞、粒细胞增殖，诱导前体细胞向DC分化，且能促进IL-12分泌，维持DC处于未成熟状态[8]，常与GM-CSF同时使用；TNF-α由单核/巨噬细胞产生，研究发现TNF-α能上调GM-CSF受体表达诱导前体细胞分化为DC并刺激其成熟，是维持成熟DC存活的必需因素[9]；SCF添加到含GM-CSF和IL-4的培养液中，可显著增加DC集落[10]。

早期研究发现人CD34+单核细胞在GM-CSF和TNF-α的培养下可分化为朗格汉斯细胞（langerhans cell）[11]，以后研究证实人外周血CD14+单核细胞在GM-CSF和IL-4存在条件下亦可以分化为具有DC典型特征及功能特征的细胞[12]，由此可见CD34+和CD14+单核细胞均可作为DC前体细胞在体外经诱导可分化为DC。利用细胞贴壁性质的差异单个核细胞直接经贴壁培养可富集CD14+单核细胞，这样经GM-CSF和IL-4诱导可提高DC的纯度[13]，但该方法仍旧不能获得大量供临床研究使用的DC。脐带血中含有丰富的CD34+单核细胞，利用其具有自我增殖的特点经体外扩增诱导可获得理想数量级的DC。研究发现脐带血单核细胞经静置培养1.5 h收集悬浮细胞，加入FLT3-L、TPO和SCF培养1周，收集悬浮细胞加入FLT3-L、TPO和SCF继续培养2周，第21天收获细胞以适当密度静置培养1.5 h弃去悬浮细胞，贴壁细胞加入GM-CSF/IL-4培养3 d后加入GM-CSF/TNF-a，第7天加入LPS、TNF-a和CD40L培养48 h可收获成熟DC[14]。由于所用细胞因子种类繁多加之操作步骤繁琐，最近有研究报道脐带血CD34+单核细胞经GM-CSF（100 ng/ml）和 SCF（50 ng/ml）连续培养 5周可增殖100 000倍，加入链球菌提取物OK-432继续培养2 d可诱导为成熟DC[15]。由于生理条件下人外周血中CD14+或CD34+单核细胞含量很少，肿瘤患者经细胞动员后收集白细胞采集物，然后分选CD34+或CD14+单核细胞进行DC分化是一种理想的方法。

二、肿瘤抗原的研究

肿瘤抗原是指细胞癌变过程中出现的新抗原、肿瘤细胞异常或过度表达的抗原物质总称，根据肿瘤特异性的程度可分为肿瘤相关抗原和特异性抗原，前者在正常细胞和组织上也存在，只是肿瘤细胞和组织含量明显增加；后者只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞。目前已经发现超过2000种肿瘤抗原。表1为目前研究比较深入的肿瘤抗原，已经在肿瘤的诊断、预防和治疗方面发挥着十分重要的作用。

表1 部分重要的肿瘤抗原

三、DC肿瘤疫苗制备方法

1.原肽体外致敏DC：该方法是最常用的负载抗原的策略，如与黑色素瘤相关的抗原gp100、MART-1、NA17及MAGE家族；与前列腺癌相关的抗原前列腺特异性膜抗原（PSMA）、前列腺酸性磷酸酶（PAP）、前列腺特异抗原（PSA）。美国FDA批准用于治疗前列腺癌的Sipuleucel-T就是患者自体抗原提呈细胞经前列腺酸性磷酸酶致敏制备而成[5]。

2.肿瘤细胞裂解物致敏DC：尽管肿瘤抗原研究取得了很大进展，但由于其获得困难或特异性不强，采用全瘤组织细胞裂解物冲击DC成为最直接的一种方法[26]。目前用来获取肿瘤裂解物的方法有反复冻融、超声破碎、辐射以及煮沸肿瘤细胞等。由于肿瘤细胞裂解物比较易于获取和制备，成为目前临床研究应用中最广泛的一种方法。

3.肿瘤全细胞与DC融合：DC与肿瘤全细胞融合后，在抗原摄取、加工处理以及随后的呈递过程中具有明显的优势。通过与肿瘤全细胞融合，DC能够呈递广谱的肿瘤相关抗原，包括已知的以及未被识别的，在共刺激分子存在的情况下，能够在MHCⅠ类和Ⅱ类分子中全部表达肿瘤相关抗原[27]。体外分离得到的DC与全瘤细胞融合后可以被再次输入到患者体内[28]，或者可以用于细胞毒性T淋巴细胞的体外诱导和扩增[29-30]。

4.基因修饰制备DC疫苗：由于大部分肿瘤患者瘤细胞的抗原基因信息以及编码的抗原不明确，或缺乏足够的瘤组织等原因而使患者失去治疗机会。DC经细胞因子、肿瘤抗原DNA或RNA修饰称之为基因修饰DC，其能较长时间地维持内源性表达所转染的基因产物，为靶向性抗原递呈提供有力的策略[31]。

四、DC肿瘤疫苗临床研究

1996年美国斯坦福大学医学中心Hsu等[32]在Nature Medicine上报道了全球首项DC肿瘤疫苗临床研究，4例滤泡性B淋巴细胞肿瘤患者接受肿瘤抗原刺激的自体外周血来源DC细胞治疗，结果显示1例完全缓解，1例部分缓解和1例临床检查显示痊愈，该试验结果令人鼓舞。一项Meta分析表明，接受DC疫苗治疗的前列腺癌和肾细胞癌患者的目标应答率分别为7.7﹪和12.7﹪，临床受益率分别为54﹪和48﹪，总缓解率分别为10.6﹪和8.4﹪[33]。基于DC肿瘤疫苗的临床研究一直是肿瘤免疫治疗的热点受到广泛关注，作者以“dendritic cell vaccine and cancer”为关键词在www. clinicaltrials.gov检索到235项临床试验，涉及的肿瘤包括白血病、骨髓瘤、黑素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、神经胶质瘤、肝细胞癌、卵巢癌及胰腺癌等。虽然以“dendritic cell and cancer vaccine”在PubMed可以检索到多达3000多个文献，但多数临床试验以患者瘤组织的裂解物致敏DC，肿瘤抗原的不确定性注定了这种DC疫苗的临床效果具有不确定性。以下对一些具有代表性和影响力的DC疫苗治疗肿瘤的临床试验进行回顾，以期借鉴一些成功的经验。

1.黑色素瘤：黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见皮肤肿瘤，恶性程度极高，具有高发病率高和高死亡率特点，研究表明免疫治疗是黑素瘤的有效治疗方法[34]。1998年Nature Medicine发表了用GM-CSF、IL-4体外培养自体DC并负载肿瘤裂解物或多肽及钥孔戚血蓝素（keyhole limpet hemocyanin，KLH）治疗晚期黑素瘤的临床研究，KLH作为外来抗原，可以通过检测迟发性过敏反应（DTH）作为判断免疫是否成功的标志，研究表明治疗的16例患者均发生DTH，5例（2例完全缓解和3例部分缓解）目标应答患者的转移灶消失（皮肤、软组织、肺脏及胰腺），这提示DC疫苗对黑素瘤有一定治疗价值[35]。一项对Ⅲ期恶性黑素瘤患者淋巴结清扫术后进行的DC疫苗临床研究表明，22例接受5～16次负载MHCⅠ类限制性黑色素瘤抗原肽DC疫苗的患者中15例出现皮肤迟发型超敏反应（DTH）和（或）产生分泌IFN-γ的CD8+淋巴细胞，治疗组的三年总生存率（OS）为68.2﹪，对照组仅为25.7﹪[36]。对54个DC疫苗治疗黑素瘤的临床试验进行回顾性分析，研究发现DC是否成熟、肿瘤Ⅲ期和Ⅳ期、是否使用佐剂、是否发生迟发性过敏反应及分泌IFN-γ的T细胞数量增加与否对疾病进展、临床反应及疾病稳定具有决定性影响[37]。

2.前列腺癌：前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，其死亡率居各种癌症的第二位。前列腺癌相关抗原主要有前列腺特异抗原（prostate specific antigen，PSA）、前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase，PAP）及前列腺特异性膜抗原（prostatespecific membrane antigen，PSMA）。28例晚期前列腺癌患者分别在第1、4和10周或者皮下注射PSA146-154和GM-CSF或者静脉注射PSA146-154致敏的自体DC，注射后第4、14、26和52周检测皮肤迟发型超敏反应（DTH），结果显示50﹪患者对PSA146-154出现DTH反应，其中13例患者在第14周或者更晚才检测到DTH反应，这提示PSA146-154可作为制备DC疫苗的有效抗原[38]。一项对于Sipuleucel-T成功上市至关重要的Ⅲ期临床试验共入组了512理例去势抵抗性前列腺癌患者（Sipuleucel-T组341例，安慰剂组171例），结果表明，与安慰剂组相比，Sipuleucel-T组的死亡风险下降了22﹪，中位生存期延长了4.1个月（Sipuleucel-T组和安慰剂组分别为25.8和21.7个月），3年生存率提高了8.7﹪；两组的客观疾病进展时间无差异；Sipuleucel-T组多见的不良反应有寒颤、发烧和头痛[39]。一项Sipuleucel-T治疗去势抵抗性前列腺癌患者的Meta分析表明，纳入分析的737例患者总生存期显著增加，但是疾病进展时间并没有增加[40]。

3.肾细胞癌：2007年5月，韩国FDA批准了称为CreaVax-RCC的自体DC疫苗用于转移性肾细胞癌的治疗，其由患者的体外诱导DC负载自体肿瘤组织裂解物及KLH制备而成[3]。临床研究共招募了9例转移性肾细胞癌患者，所有患者接受2个疗程的CreaVax-RCC治疗（每个疗程由4次间隔2周的DC皮下注射构成），结果为1例部分缓解、5例病情稳定及3例疾病进展，中位疾病进展时间和总体生存期分别为5.2和29.0个月；CreaVax-RCC的耐受性良好，无严重毒性作用[41]。

五、安全性

值得注意的是肿瘤的临床研究表明，自体DC疫苗没有很大的毒性副作用。早期试验中，1000个患者接受DC疫苗治疗后没有住院治疗或者死亡现象出现[42]。已报道DC疫苗的副作用主要有头痛，肌痛，发烧，局部的注射部位反应，感冒类症状，疹子，恶心，呕吐，疼痛和疲劳等。这些DC疫苗的毒性反应无剂量依赖性，且与DC注射数目无相关性。一些毒性源自DC疫苗的自身免疫性这一理论推断。然而，自身免疫性毒性的临床表征非常少见，或许是DC疫苗试验中的患者排除了免疫障碍的缘故。在一些黑色素瘤患者试验中，DC疫苗注射后出现白斑的临床症状，被认为是DC疫苗诱导的自身免疫反应现象[43]。

六、问题和展望

基于DC肿瘤疫苗偏具有个性化治疗特点，所以诸如DC获得的方法、肿瘤抗原的选择、治疗方案的制定等均可影响DC疫苗的治疗效果。尽管DC肿瘤疫苗已经呈现出令人鼓舞的应用前景，但仍旧有许多问题有待解决，包括诸如肿瘤抗原的不确定性、DC亚群的异质性及其递呈能力差等多个方面。目前我国的DC肿瘤疫苗是按照第三类医疗技术监管还是新药监管的政策尚未出台，但借鉴美国FDA批准Sipuleucel-T的案例可以看出疫苗的制备具有规范性是其成功的必要条件，例如肿瘤抗原的选择和确定。虽然近年基于DC肿瘤疫苗的临床研究报道日趋增多，但多数临床试验以患者瘤组织的裂解物致敏DC，肿瘤抗原的不确定性注定了这种DC疫苗的临床效果具有不确定性，目前多种肿瘤缺乏肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原，对于肿瘤抗原研究明确的肿瘤是DC疫苗研究的重点。由于自体外周血来源的DC疫苗具有安全性和有效性，临床研究所用DC仍以患者自体DC为主。但目前的体外扩增方法只能获取有限DC需频繁采集患者外周血，对体外扩增体系需要进一步研究以获得能满足治疗用细胞数目。

随着肿瘤免疫学和临床肿瘤治疗学的发展，基于DC肿瘤疫苗的肿瘤免疫疗法单一或联合其他疗法可有效清除手术、放化疗后残余的癌细胞及微小病灶，预防肿瘤的复发和转移，可弥补手术、放疗及化疗等传统疗法的弊端。

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