蛛网膜下腔移植脐血干细胞治疗一氧化碳中毒后迟发性脑病的临床研究

宫殿荣 于海燕 芦倩

一氧化碳（carbon monoxide, CO）是工业和生活中气体吸入性中毒的常见原因，在美国每年有超过40 000例急性CO中毒的报道[1]，目前在我国还无具体的统计数字。急性CO中毒后3﹪～ 30﹪的患者抢救成功后，经过2～60 d的“假愈期”后出现以神经精神症状为主，伴有学习记忆障碍、锥体及锥体外系统功能障碍的临床症状，称为一氧化碳中毒后迟发性脑病（delayed encephalopathy after carbon monoxide poisoning,DEACMP）[2-3]。以往都采用高压氧、自由基清除剂、神经营养药物等传统治疗手段，但无确切疗效，患者预后仍较差，有些甚至死亡。本研究自2010年3月至2012年2月对在山东省聊城市人民医院神经内科住院的12例DEACMP患者进行了脐血干细胞治疗作为治疗组，并对2008年3月至2010年2月住院的14例高压氧治疗的DEACMP患者进行回顾性追踪分析作为对照组，现报告如下。

资料与方法

一、临床资料

本研究共选择DEACMP患者26例，均经泰山医学院附属聊城医院神经内科住院治疗。按治疗方式分两组，其中12例经脐血干细胞移植治疗为治疗组，14例经高压氧治疗为对照组，两组病例的年龄、昏迷时间、假愈期、病情按简易智能精神状态检查量表(mini-mental state, MMSE)评分、日常生活能力评定（activities of daily living scale, ADL）评分差异无统计学意义（P>0.05，表1）。

表1 26例DEACMP患者干细胞治疗前基本情况

二、方法

（一）病例诊断标准、入选标准及排除标准

1.诊断标准：CO中毒后，经过一段时间“假愈期”（一般为2～60d）出现迟发性脑病的症状，可出现下列临床表现之一：（1）精神及意识障碍，呈痴呆状态，谵妄状态或去大脑皮层状态；（2）锥体外系受损，出现帕金森综合征的表现；（3）锥体系受损（如偏瘫、病理反射阳性或小便失禁等）；（4）大脑皮层局灶性功能障碍，如失语、失用、认识、记忆、计算功能缺损，视野缺损等，或出现继发性癫痫。

2.病例入选标准：(1)患者年龄在40～80周岁以内；(2)既往体健，无严重感染、结核、糖尿病等慢性病及严重脏器功能不全等情况；(3)能够配合检查和治疗过程；(4)随访(门诊、电话及信件等)合作信息无丢失者。

3.排除标准：(1)合并以下任一情况：专科疾病、免疫系统疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病或有严重的器官功能障碍者；(2)存在严重的感染性疾患未被控制者；(3)肿瘤患者。

（二）病例剔除和脱落

患者未完成随访而影响疗效判断的病例，作为脱落处理。

（三）临床表现

26例患者均在假愈后急性起病，进展迅速，首发症状均为智能障碍，余症状体征主要有意识障碍、精神行为异常、去皮层状态、锥体外系症状、小便失禁、肌张力增高等（表2）。

（四）辅助检查

颅脑CT示26例患者均有异常，表现为双侧额、顶、枕叶半球白质、双侧苍白球、豆状核及内囊后肢可见对称性片状低密度影，边界模糊。26例患者血、尿、便常规，生化指标均无明显异常，脑脊液常规均正常，肿瘤标记物均在正常范围。

（五）治疗方法

1.脐血干细胞治疗：脐血标本由聊城市人民医院妇产科提供，无菌条件下取正常剖宫产健康产妇志愿捐献的新鲜脐带血约150～200 ml(乙肝七项、艾滋病、梅毒等其它相关传染性指标均呈阴性)，并由产妇签署知情同意。患者于治疗前均签订知情同意书。在我院中心实验室用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，得到5 ml单个核细胞悬液，其中单个核细胞（mononuclear cell,MNC）总数108～109，细胞存活率99.9﹪。提取后30 min内注入蛛网膜下腔。因脐血干细胞为分化未成熟的原始细胞，其表面的抗原表达非常微弱没有免疫原性，能够诱导免疫耐受，有较强的免疫调节作用，不产生排斥反应，因此治疗前无需配型。

2.高压氧治疗：采用国产纯氧舱加压至0.2 mPa稳定后持续低流量换气，保持氧浓度75﹪以上，连续吸氧40min，治疗总时间为80min，1天1次，疗程为4周。

3.其他药物治疗：除给予对症处理外，两组均给予常规应用神经细胞活化剂、血管扩张剂、抗凝剂以及维生素B1、B6、C治疗及护理措施，改善脑部缺氧状态、微血管损伤和细胞通透性，减轻脑水肿，降低红细胞和血小板聚集性，防止白色微小血栓出现，预防并发症。糖皮质激素、镇静药、抗癫痫药等根据患者的具体情况使用。

表2 26例DEACMP患者治疗组与对照组患者出现相应临床症状和体征情况[例（﹪）]

（六）观察指标

1.分别对两组患者治疗前及治疗后1个月、3个月、6个月、1年进行MMSE评分和ADL评分。MMSE评分标准：总分25分，共5项，13～23分为轻度痴呆；5～12分为中度痴呆；< 5分为重度痴呆。ADL评分标准：总分100分，共10项，轻度障碍>75分，中度障碍50～75分，重度障碍0～49分。

2.12个月后复查颅脑CT。

（七）疗效判定

疗效评定标准：有效率=（末期评定分总数一初期评定分总数）÷两表总分× 100﹪。痊愈：总分提高90﹪或以上；显效：总分提高70﹪～ 89﹪；有效：总分提高40﹪以上；无效：总分低于40﹪及死亡者。

三、统计学分析方法

采用SPSS13.0统计软件，两组患者的年龄、昏迷时间、假愈期、MMSE评分分值、ADL评分分值用± s表示，其中两组患者组间MMSE评分分值、ADL评分分值的比较采用独立t检验，组内不同时间评分分值比较用单因素方差分析，临床疗效及CT评定结果比较采用卡方检验，以P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、安全性

所有患者在干细胞移植术中均无特殊不适感，术中及术后24 h内生命体征平稳，无发热，无穿刺点感染、出血等，对所有患者进行术后门诊随访，均未出现移植相关并发症。

二、MMSE评分

分别于治疗前、治疗1个月后、治疗3个月后、治疗6个月后、治疗1年后两组患者MMSE评分结果，治疗组治疗前后比较，差异有统计学意义，P< 0.01。1年后对照组MMSE评分差异亦有统计学意义，P< 0.05(表3)。

表3 26例DEACMP患者治疗前后不同时间两组MMSE评分结果（分，±s)

表3 26例DEACMP患者治疗前后不同时间两组MMSE评分结果（分，±s)

注：与治疗前比较，aP < 0.01, bP < 0.05

组别 例数 治疗前 治疗1个月 治疗3个月 治疗6个月 治疗1年 F 值 P 值对照组 12 1.57 ± 1.83 4.50 ± 4.43 7.57 ± 6.22 10.07 ± 8.42 11.7 ± 10.33 b 4.234 0.005治疗组 14 0.75 ± 1.29 6.08 ± 5.87a 18.4 ± 8.01a 23.50 ± 6.02a 25.08 ± 4.10a 53.387 0.000 t 值 1.335 0.764 3.780 4.729 4.465 P 值 0.194 0.453 0.001 0.000 0.000

三、ADL评分

分别于治疗前、治疗1个月后、治疗3个月后、治疗6个月后、治疗1年后两组患者ADL评分结果，治疗组治疗前后比较，ADL评分差异有统计学意义（P<0.01）。1年后对照组ADL评分差异亦有统计学意义（P< 0.05，表4)。

表4 26例DEACMP患者治疗前后不同时间两组ADL评分结果（分，±s）

表4 26例DEACMP患者治疗前后不同时间两组ADL评分结果（分，±s）

注：与治疗前比较，a P < 0.01

组别 例数 治疗前 治疗1个月 治疗3个月 治疗6个月 治疗1年 F 值 P 值对照组 12 4.64 ± 6.64 12.50 ± 12.52 20.36 ± 19.36 28.21 ± 27.22 41.07 ± 38.39 a 4.271 0.004治疗组 14 5.00 ± 8.79 30.42 ± 14.69a 77.08 ± 18.89 a 91.67 ± 17.62 a 93.33 ± 13.37 a 96.853 0.000 t 值 0.116 3.316 7.546 7.159 6.152 P 值 0.909 0.003 0.000 0.000 0.000

四、影像表现及复查结果

在入院1周内所有患者均接受了CT检查，均显示程度不同的双侧大脑皮质下白质及苍白球或内囊呈大致对称的密度减低区。1年后治疗组12例、对照组10例复查了CT，治疗组有10例比原影像异常低密度区消失或缩小，对照组有3例比原影像异常低密度区消失或缩小，差异有统计学意义（表5）。

表5 26例DEACMP患者1年后头颅CT结果的比较[例（﹪）]

五、临床疗效评定

1年后，对照组14例患者，痊愈1人，显效2例，好转4例，无效7例（其中2例死亡，2例目前仍处植物状态）。治疗组12例患者痊愈6例，显效5例，好转1例，无效0例。两组比较有显著性差异；对照组总有效率为50﹪，治疗组的总有效率为100﹪，差异有统计学意义（表6）。

表6 26例DEACMP患者治疗1年后临床疗效的比较[例（﹪）]

讨 论

多数DEACMP患者以痴呆及小便失禁为首发表现，其常见临床症状有智能障碍、锥体外系统功能障碍、锥体系损害、精神症状等，其病理改变主要为基底节区缺血性坏死、脑白质广泛脱髓鞘病变、海马坏死及皮层局灶性坏死等[4]。DEACMP的发病机制目前尚不明确，急性CO中毒后脑组织的缺血缺氧学说不能完全解释DEACMP的发生，随着研究的深入，关于发病机制的学说主要有中毒后一氧化氮大量生成、氧自由基损伤、细胞凋亡和免疫炎症反应等[5-8]。并且DEACMP的发生还与患者年龄、CO中毒程度、昏迷时间和急性中毒后停止治疗时间过早等因素有关[9]。在治疗上，高压氧治疗在急性中毒期能迅速促进碳氧血红蛋白解离，快速改善大脑缺氧状态，但在DEACMP发生后，神经细胞病理改变已经产生，现在无证据证明高压氧对DEACMP有益，并且有些研究结论之间相互矛盾。另外自由基清除剂、脱水剂、促进脑代谢药物及中医中药等治疗手段，都无确切疗效。目前对DEACMP的治疗尚无有效方法。

观察显示患者进行干细胞治疗与高压氧治疗后3个月MMSE、ADL评分有差异性，6个月、1年后的MMSE、ADL评分均有显著差异性（P<0.001），差异具有统计学意义；患者在症状明显好转后复查颅脑CT可见低密度灶范围明显缩小或消失，差异亦具有统计学意义。结果说明蛛网膜下腔脐血干细胞移植是治疗DEACMP的有效方法，疗效优于传统高压氧治疗。

脐血是胎儿出生时脐带内和胎盘近胎儿一侧血管内的血液。脐血干细胞具备自我更新和增殖的能力，并能在特定因素的影响或诱导下，向各种细胞或组织分化[10-12]。脐血干细胞相比其它种类干细胞有来源丰富、采集方便、增殖分化能力更强、免疫原性弱及无伦理学问题等优点[13-16]。用密度梯度离心法得到的脐血干细胞悬液包含丰富的间充质干细胞，有研究表明，这类干细胞可在特定条件下分化为神经前体细胞[17]，代替受损细胞，重建神经传导束。

对12例患者进行干细胞移植后有效率为100﹪，说明脐血干细胞对DEACMP有较好的疗效，可显著改善患者的预后。目前脐血干细胞治疗神经科疾病的机制尚不明确，有实验证实脐血干细胞能够替代胚胎来源的神经干细胞治疗神经系统疾病[18-19]。有动物实验表明，脐血干细胞能定向迁移至受损神经组织并存活，改善神经损伤后遗症[20-21]。结合DEACMP的病理特点，推测脐血干细胞治疗DEACMP的机理可能有[18-23]：（1）脐血干细胞在脑内可定向分化为神经元细胞和神经胶质细胞，替代受损神经细胞，重建突触和神经网络；（2）干细胞可分泌多种因子，如神经生长因子、脑源性神经营养因子等。这些因子不仅单独起作用，而且能够相互间发挥协同作用，这些是组织细胞修复必需的，这也是其他任何一种药物所不具备的独特功能。（3）脐血干细胞可减少神经细胞的细胞凋亡、促进内源性神经干细胞增殖、促进血管新生及促进轴突髓鞘的修复等。

在移植途径上，选择穿刺蛛网膜下腔途径，该途径操控性好，创伤小，注入的干细胞可顺脑脊液循环途径流遍整个大脑，无血脑屏障的阻碍。所以蛛网膜下腔途径是一种相对效率较高的、可行的干细胞移植手段。并且全部患者均无不良反应，所以此方法在临床应用中更为实用、简便和安全。

从病例中可见，脐血干细胞治疗能有效阻止和减轻DEACMP继发性脑损伤，明显促进神经功能恢复，甚至能够达到治愈，是一种安全的、有效的、可行的生物治疗方法，它为DEACMP患者带来了希望，为医学事业的发展注入了新的力量！

1 高春锦.急性一氧化碳中毒及其迟发脑病的诊断和治疗展望[J].中华航海医学与高气压医学杂志, 2002,9(03):133.

2 陆再英,钟南山.内科学[M].7版.北京:人民卫生出版社, 2008:935-938.

3 Choi IS, Cheon HY. Delayed movement disorders after carbon monoxide poisoning[J]. Eur Neurol,1999,42(3):141-144.

4 Kim JH, Chang KH, Song IC, et a1. Delayed encephalopathy of acutecarbon monoxide intoxication:diffusivity of cerebral white matter lesions[J]. AJNR Am J Neuroradiol, 2003, 24(8):1592-1597.

5 Gorman D, Drewry A, Huang YL, et a1. The clinical toxicology of carbon monoxide[J]. Toxicology, 2003,187(1):25-38.

6 Stephen R, Hom S, Tsuyoshi S, et al. Nitric oxide released by platelets inhibits neutrophil B2 integrin function following acute carbon monoxide poisoning[J]. ToxicalApp l Pharmacol, 1994, 128 (1):105-111.

7 Tofighi R, T illmark N, Dare E, et al. Hypoxia-independent apoptosis in neural cells exposed to carbon monoxide in vitro [J] . Brain Res, 2006, 1098(1):1-8.

8 Thom SR, Bhopale VM , Han ST , et al. Intravascular neutrophil activation due to carbon monoxide poisoning [J].Am J Respir Crit Care Med, 2006, 174(11):1239-1248.

9 Mares M, Bertolo C, Terribile V, et al. Hemorthological study in patients with coronary artery disease[J].Cardiology, 1991, 78(2):111-116.

10 Musina RA, Bekehanova ES, Belyavskii AV, et a1.Umbilical cord blood mesenehymal stem cells[J]. Bull Exp Biol Med, 2007, 143(1):127-131.

11 Kim JS, Lee HK, Kim MR, et a1.Differentially expressed proteins of mesenehymal stem cells derived from human cord blood(hUCB)during osteogenic differentiation[J].Biosci Biotechnol Biochem, 2008, 72(9):2309-2317.

12 Berger MJ, Adams SD, Tigges BM, et a1.Differentiation of umbilical cord blood-derived muhilineage progenitor cells into respiratory epithelial cells[J]. Cytotherapy, 2006,8(5):480-487.

13 Bradley MB, Cairo MS. Cord blood immunology and stem cell transplantation[J]. Hum Immunol, 2004, 66(5):431-446.

14 Broxmeyer HE, Douglas GW, Hangoc G, et al. Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989, 86(10):3828-3832.

15 Gluckman E, Broxmeyer HA, Auerbach AD, et al.Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling[J]. N Engl J Med, 1989, 321(17):1174-1178.

16 Plett PA, Frankovitz SM, Bonour R, et al.Proliferation of human hematopoietic bone marrow cells in simulated microgravity[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2001,37(2):73-78.

17 Jeong JA, Gang EJ, Hong SH, et al. Rapid neural differentiation of human cord blood-derived mesenchymal stem cells[J]. Neuroreport, 2004,15(11):1731-1734.

18 牛朝诗, 李健, 傅先明, 等. 骨髓间质干细胞的分离培养及向神经细胞分化的研究[J].立体定向和功能性神经外科杂志, 2004, 17(2):89-92.

19 Pluchino S, Quattrini A, Brambilla E, et al.Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis[J]. Nature, 2003, 422(6933):688-694.

20 Ankeny DP, McTigue DM, Jakeman LB. Bone marrow transplants provide tissue protection and directional guidance for axons after contusive spinal cord injury in rats[J]. Exp Neurol, 2004, 190(1):17-31.

21 Satke K, Lou J, Lenke LG. Migration of mesefchymal stem cells through cerebrospinal fluid into injureD spinal cord tissue[J]. Spine, 2004, 29(18):1971-1979.

22 Jin GZ, Cho SJ, Choi EG, et al. Rat mesenchymal stem cells increase tyrosine hydroxylase expression and dopamine content in ventral mesencephalic cells in vitro[J].Cell Biol Int, 2008, 32(11):1433-1438.

23 Weiss ML, Medieetty S, Bledsoe AR, et a1. Human umbilical cord matrix stem cells:preliminary characterization and effect of transplantation in arodent model of Parkinson’s disease[J]. Stem Cells, 2006,24(3):781-792.