空间微重力环境及其地基模拟微重力条件对干细胞影响的研究

张翠 李亮 王金福

空间医学研究发现，空间飞行可导致心血管功能障碍、骨密度丢失、肌肉萎缩、免疫功能下降、内分泌功能紊乱、空间运动疾病等多种生理及病理变化。生物个体的表现是通过细胞水平表现出来的。因此，空间环境对离体细胞的影响越来越受到重视。干细胞作为一类具有增殖和分化潜能的特殊细胞，研究和应用广泛，在空间生物医学中的研究也逐渐受到关注。

对人体有影响的空间环境主要是微重力和辐射，而微重力作为人们在太空活动中不可避免的一个重要的环境因素，其对细胞形态、增殖、分化和信号传导方面有广泛的影响。本文就今年来空间微重力环境以及地基模拟微重力条件对各种干细胞影响的研究进展进行综述。

一、微重力对间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的影响

MSC是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。在体内或体外特定诱导条件下，MSC可分化为脂肪、骨、软骨、神经、肝、内皮、心脏等多种组织细胞。

1.微重力影响MSC的形态和增殖：地面模拟微重力实验表明，相较于正常培养条件下的成纤维细胞状态，在微重力环境中的MSC形态更加扁平，细胞汇合密度更低[1]；Gershovich等[2]研究发现，在模拟微重力下，骨髓MSC的肌动蛋白骨架被破坏，黏着斑蛋白的分布发生了改变，整合素-α2的表达增加。他们还发现表达VCAM-1的细胞数量明显增加，并且细胞中ICAM-1的表达发生变化，提示微重力会导致人MSC的微丝发生可逆性变化，并引起细胞黏附性改变。Zhang等[3]利用卧式回旋生物反应器模拟微重力培养犬MSC，并通过扫描电镜进行检测，发现反应器中培养的细胞生长速度、数量及形态比静止状态培养的细胞要好。Yuge等[4]通过三维回旋器微重力培养人MSC也得出相似的结论。但是，Dai等[5]利用回旋器模拟微重力研究大鼠骨髓MSC，结果显示鼠骨髓MSC增殖受到抑制，细胞周期阻断在G0/G1期。KUBIK空间飞行任务ISS 12S中进行的骨髓MSC空间试验结果显示，在太空飞行中的细胞增殖受到抑制，细胞周期基因的表达下降[6]。分析上述两种结果出现的原因有可能是进行试验的方法不同导致细胞处于不同的生长条件下，从而对MSC的增殖产生不同的影响。

2.微重力影响MSC的分化：重力是影响MSC分化的一项重要因素：超重状态诱导MSC向力学敏感性细胞如成骨细胞和心肌细胞分化，而失重状态则促使MSC向脂肪细胞等力学不敏感性细胞分化[7]。地面模拟微重力实验发现在微重力环境下，MSC不能表达成骨向分化的标志分子，如碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨连接蛋白，并且调节成骨分化的Runt相关转录因子-2（Runx2）的表达受到抑制；但对脂肪分化具有重要促进作用的过氧化物酶体增值激活受体-2（PPARγ2）、降脂蛋白、瘦蛋白和葡萄糖转运蛋白4的表达则显著增加。这表明微重力抑制MSC的成骨分化，促进其成脂分化。通过进一步研究发现，在微重力环境中MSC的ERK磷酸化降低，P38磷酸化增加，而这些信号分子与Runx2和PPARγ2的活性调节有关[8]。Meyers等[9]研究发现在模拟微重力下，整联蛋白/MAPK通路活性的降低对人MSC的成骨分化有显著的影响。该研究团队还发现，微重力抑制微丝支架的形成及RhoA的活性来抑制人MSC的成骨分化和促成脂细胞的分化[10]。MSC的分化潜能还与端粒酶的活性有关[11]。Zheng等[12]进一步采用能促进Runx2表达的BMP、促进ERK磷酸化的FGF2以及和抑制P38/MAPK的SB203580抑制剂等3种因子，通过调控人MSC中Runx2和PPARγ2的表达以及ERK和P38MAPK磷酸化来调节微重力下人MSC的成骨分化，表明微重力通过不同的信号抑制人骨髓MSC的成骨分化，促进其成脂分化。王会长等[13]通过与静态培养相比较发现，微重力条件下动态三维培养的人骨髓MSC中II型胶原和蛋白聚糖显著增加，提示微重力促进人骨髓MSC的软骨分化。Yu等[14]研究发现，微重力通过P38MAPK信号诱导ADSC的软骨分化。Chen等[15]等在模拟微重力及神经细胞分化培养基中培养人MSC，发现与正常培养比较，微重力中鼠间充质细胞的MAP-2、TH和CHAT的表达增加，并且随着时间的增长，鼠MSC分泌更多的NGF、BDNF和CNTF。上述结果表明微重力促使间充质向神经细胞分化。空间飞行试验的结果表明骨髓MSC中表达改变的基因大部分都与神经发育，神经形态，神经冲动和突触的传递有关[6]。Luo等[16]还研究发现，微重力刺激MSC向髓核细胞样表型的分化。TGF-β1在微重力下促进刺激MSC向髓核细胞样表型的分化[17]。在特定的诱导条件下，模拟微重力还能促进MSC向内皮细胞[18]和心肌细胞[19]分化。

二、微重力对造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）的影响

HSC是骨髓中的干细胞，具有自我更新并分化为各种血细胞前体细胞的能力，最终可生成各种血细胞，包括红细胞、白细胞和血小板等。

1.微重力影响HSC的增殖和迁移：微重力通过改变骨髓CD34+细胞的骨架及细胞周期来改变其迁移能力。在模拟微重力环境中，骨髓CD34+细胞的SDF-1α定向迁移显著减少，F-actin的表达降低，细胞周期动力学发生改变，细胞周期的S期延长，细胞周期素A的表达降低，说明微重力显著抑制骨髓中CD34+细胞的迁移能力，抑制细胞周期的进行。Plett等[20]认为这也许就是宇宙飞行过程中血液系统异常的原因。CD34+细胞培养在正常重力下4～6 d增殖3倍，在微重力环境下的细胞则不增殖。一个可能的解释是在微重力下的细胞退出G0/G1期比正常对照的要晚[21]。龙星星等[22]研究了人红白血病细胞—K562细胞在RCCS系统中的生长状况，发现模拟微重力环境抑制K562细胞的增殖，使细胞周期阻滞于G0/G1期，认为这可能是由于在模拟微重力作用下ERK1/2的磷酸化水平下降所导致。研究发现乘坐Cosmos-2044生物实验卫星14 d宇宙飞行后的大鼠骨髓中红细胞、粒细胞、巨噬细胞及造血细胞祖细胞的数量与地面对照组相比明显减少[23]。在航天飞行任务STS-63及STS-6922中[24]，与地面对照组相比，总细胞的扩增数减少57﹪～84﹪（41.0～65.5倍/10.1～17.6倍）；骨髓祖细胞数量分别扩增2.6～17.5倍与0.9～7.0倍；红细胞祖细胞的扩增倍数也降低83﹪以上。失重还使得大鼠骨髓中部分HSC及单核-巨噬细胞和红细胞的前体细胞减少[25]。后续的研究中发现，骨髓CD34+细胞在旋转壁式生物反应器（rotating wall vessel bioreactor，RWVB）环境中培养4～6 d时，其增殖受到抑制[26]。这些结果显示微重力会直接抑制造血原始细胞的增殖分化，尤其对红系原始细胞的抑制作用更明显。

2.微重力对HSC分化的影响：Plett等[21]研究发现，在模拟微重力下培养14～18 d的骨髓CD34+细胞向骨髓细胞分化而不行红细胞分化，表明微重力影响骨髓CD34+细胞的分化模式。对太空飞行的大鼠进行血液学检测发现，大鼠的细胞比容、红细胞数量及血红蛋白检测显著降低，中性粒细胞及白细胞有少许增加，骨髓和脾细胞分化以及促血红细胞生成素没有明显的改变[27]。收集太空飞行大鼠的骨髓祖细胞并进行恢复培养后发现，飞行过的大鼠总白细胞数量减少，淋巴球以及单核细胞的绝对数量也减少，并且相较于地面对照组，实验组中拥有更少的CD4、CD8、CD2、CD3以及B细胞，但脾脏淋巴细胞没有明显的差异[28]。龙星星等[22]研究还发现模拟微重力抑制hemin诱导的K562细胞分化，红细胞生成减少，从而证实在微重力环境下“航天贫血症”的发生。他们还发现微重力未抑制GATA-1的表达，认为K562分化受到微重力的抑制与GATA-1无关。

微重力在人脐静脉血干细胞向血管内皮诱导以及细胞增殖方面也有重要的作用[29]。从废弃的人脐静脉血样本中分离CD34+单核细胞，将它在微重力下培养14 d。在培养过程中添加血管内皮生长因子的前提下，微重力条件下出现了明显的3D组织样集落细胞增殖。在第4天，培养在微重力下的CD34+细胞生成了血管样结构，并表达内皮细胞标志。

三、重力对牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）的影响

PDLSC是牙周组织再生最直接、最可靠的种子细胞，也是牙周缺损细胞治疗和基因治疗重要的细胞学基础。在牙周病治疗、种植体周围软硬组织缺损修复、正畸牙移动过程中的修复与重建中均发挥重要作用。

1.微重力影响牙周膜干细胞的形态和增殖

模拟微重力能促进牙周膜干细胞的增殖和生存能力，改变其形态，并造成微丝结构的解体[30]。这种微丝结构的改变呈时间依赖性并使细胞迁移能力下降[31]。微重力环境下的牙周膜干细胞呈半球形，少数铺展为不规则扁平或长梭型，生长速度明显增加[32]。利用微重力环境，可以获得大量的体外牙周膜干细胞，为构建工程化的牙周组织奠定了实验基础。

2.微重力影响牙周膜干细胞的分化机制

在成骨诱导培养基中，微重力增加牙周干细胞的矿化沉积，并且矿化相关基因的表达上调[30]。Li等[33]研究发现，Smad2、3和4的表达在微重力环境中以一种时间依赖性的方式显著增加，p-Smad在30 min的时候高度表达，第2个小时表达水平达到峰值（91.32﹪），而SIS3（一种Smad3 磷酸化的特异性抑制剂）的添加导致Col2、ALP、OCN和p-Smad的表达下降。这表明，在微重力环境下，Smad信号促进牙周干细胞的成骨分化。李石等[34]研究也得出了相似的结论。另外，他们还发现，TGF-β1通过Smad信号通路促进牙周膜干细胞的成骨/成牙骨质向分化。该研究团队的进一步研究表明，IGF-1在模拟微重力环境下对牙周膜干细胞表现出促增殖、促成骨向分化的作用，他们认为IGF-1可能通过调节干细胞表达OPG/RANKL参与破骨细胞的生成和活化过程[35]。

四、微重力对胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC ）的影响

ESC简称ES或EK细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类干细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。

微重力影响胚胎干细胞的数量。Wang等[36]发现，在微重力环境中胚胎干细胞的总数量相较于正常培养明显减少，但实验组与对照组之间的细胞周期并没有明显的差异，这表明微重力造成胚胎干细胞的主要原因并不是损害其增殖而是破坏其贴壁性。同时，他们还发现单纯的微重力对细胞DNA的损害并不严重，但是微重力会影响辐射造成的DNA损伤的修复。因此，微重力从细胞贴壁性下降，凋亡率增加和阻止受损DNA的修复等方面来影响胚胎干细胞。

微重力对胚胎干细胞的分化具有显著的影响。研究发现，回旋器中培养的胚胎干细胞可以分化成具有成熟肝细胞典型特征的肝细胞样细胞，这些细胞植入小鼠体内可进一步的增殖和分化[37]。刘卫生等[38]研究了模拟微重力下小鼠胚胎干细胞拟胚体的形成和分化，结果表明胚胎干细胞在模拟微重力条件下可大量快速形成拟胚体，并伴随有内皮样细胞、成纤维样细胞、肝细胞样细胞、血管样细胞及可自发搏动的心肌样细胞等不同类型组织细胞的分化。

五、微重力对肝脏干细胞（liver stem cell）的影响

姚新宇等[39]发现在模拟微重力三维微载体培养中，肝干细胞呈三维立体结构生长，微重力有利于细胞快速增殖并维持细胞的活性和表型。同时。WB-F344肝干细胞的模拟微重力培养也发现，WB-F344细胞增殖较静止状态有明显的增加[40]。但是，Talbot等[41]在STS-126飞行试验中发现，太空环境中PICM-19猪肝细胞的生长和分化未有明显的影响，飞行中PICM-19细胞密达到79﹪，几乎没有凋亡和坏死。曲鑫建等[40]通过研究模拟微重力对WB-F334肝干细胞表征分子表达的影响，发现在模拟微重力下肝干细胞特异性基因甲胎蛋白（AFP）的表达强度及AFP阳性细胞的数量均显著高于静止培养组，而白蛋白（ACB）mRNA的表达强度和ACB阳性细胞均低于对照组，说明模拟微重力能较好的维持肝干细胞的特性。

六、微重力对其他干细胞的影响

Chiang等[42]发现微重力能促进人神经干细胞的增殖。研究发现微重力环境诱导β-肾上腺受体，上调cAMP形成和激活PKA和CREB（cAMP效应元件结合蛋白）通路。在微重力环境中细胞内的线粒体中受CREB调节的基因，包括PGC1α（PPAR共激活剂1α）、NRF1/2和线粒体转录因子A的表达量显著增加，并且ATP和线粒体的量也是增加的。因此，Chiang等[42]认为微重力诱导人神经干细胞的增殖是通过增加线粒体的功能。

模拟微重力系统也可促进表皮干细胞的增殖和分化。Lei等[43]利用回旋生物反应器来模拟微重力条件，研究微重力环境下人表皮干细胞（hEpSC)的增殖和分化。从儿童包皮中分离的hEpSC在回旋生物反应器中培养15 d。结果表明，在模拟微重力条件下人表皮干细胞表现出更强的增殖和生存能力。同时，免疫染色分析显示Ki67+细胞所占的比例在模拟微重力下高于静态培养。培养至第10天时，微重力下表皮干细胞表达的外皮蛋白较正常条件下的减少。组织学分析表明在微重力环境中表皮干细胞是聚集的，并且形成了三维的表皮结构。这项研究为多层表皮结构的构建提供了新的思路。

七、结语

本文总结了以往空间及地基模拟环境中微重力对干细胞影响的研究进展。尽管这种研究已在多种干细胞中展开，但是大部分的研究仍停留在细胞形态和数量等表型变化上，空间环境对干细胞影响的具体机制尚未清楚，有待更深入的研究。此外，空间生命科学的研究大部分都是通过地面模拟实验来进行的，与空间环境的复杂性和真实性的差异导致人们无法得到正确的，有说服力的结论。因此，为了使空间生命科学的研究更加顺利和准确，无论是地面还是飞行实验，都必须有相应的硬件设备，需要基于地面先进培养技术和空间飞行环境的考虑，发展高度智能化的专用空间仪器、设备和合理的实验方法和技术。

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