肾小球滤过屏障超微结构改变与Alport综合征蛋白尿的关系*

王海燕， 孙良忠△， 吴金浪， 蒋小云， 莫 樱， 童华娟

(中山大学 1附属第一医院儿科，2中山医学院电镜室,广东 广州 510080)

肾小球滤过屏障超微结构改变与Alport综合征蛋白尿的关系*

王海燕1， 孙良忠1△， 吴金浪2， 蒋小云1， 莫 樱1， 童华娟1

(中山大学1附属第一医院儿科，2中山医学院电镜室,广东 广州 510080)

目的探讨肾小球滤过屏障超微结构改变与Alport综合征(AS)蛋白尿发生的关系。方法AS患者35例，男24例，女11例，肾活检的年龄为1.17～24岁。根据尿蛋白结果将患者分为2组：无/间歇性蛋白尿组(13例)和持续性蛋白尿组(22例)。测量AS肾小球基底膜(GBM)变薄、增厚和致密层撕裂分层的长度，计算其各占GBM总长度的百分比；根据平均足突宽度(FPW)= π/4×(∑基底膜长度/∑足突个数)计算患者足突宽度。分析比较2组患者GBM变薄、增厚、致密层撕裂分层比例和平均FPW及其与AS蛋白尿的关系。结果持续性蛋白尿组GBM增厚、致密层撕裂分层比例和平均FPW较无/间歇蛋白尿组高(均P<0.05)。平均FPW与GBM增厚、致密层撕裂分层及肾活检年龄均呈正相关(均P<0.01)。结论AS患者GBM病变程度越重，足突融合越严重，蛋白尿越严重,提示AS基底膜异常有可能通过影响足突及裂孔膜的结构和功能导致蛋白尿发生。

Alport综合征; 肾小球基底膜; 足细胞; 蛋白尿

Alport综合征(Alport syndrome，AS)是一组以进行性肾炎、感音神经性听力损害和眼部病变为特征的临床综合征[1]。AS是肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)IV型胶原α3、α4或α5链遗传缺陷所致，多在10岁以前起病，部分患者在青春期甚至青春期前发展为终末期肾病[2]，其典型的病理改变是GBM分层撕裂、增厚和变薄和厚薄不均[2]。血尿是AS最早期且持续的临床表现，随着疾病进展蛋白尿逐渐出现[2]。持续蛋白尿预示着肾小球功能将进行性恶化[3]，但其发生机制尚未清楚。肾小球滤过屏障由足细胞足突和裂孔膜、GBM和带窗孔的内皮细胞组成[4]。裂孔膜是血浆蛋白滤过的主要屏障，蛋白尿的出现提示足突和裂孔膜损伤[5]。本研究通过观察AS肾小球足突融合程度与GBM损伤(变薄、增厚和致密层撕裂分层)范围以及蛋白尿的关系，以进一步理解和探讨AS蛋白尿发生的可能机制。

材 料 和 方 法

1对象

对我院2008年1月～2012年4月确诊的AS临床、电镜资料进行回顾性分析。AS诊断参照Flinter指定的标准，符合以下标准之一[1]：(1)肾小球基底膜或皮肤基底膜IV型胶原α链染色异常；(2)电镜下有典型的超微结构改变；(3)COLA3～5突变。

AS共35例，男24例，女11例，均行肾活检病理检查，包括光镜、免疫荧光及电镜检查。肾活检的年龄为1.17～24岁(中位年龄6岁)。根据肾活检前的尿常规蛋白定性结果将患者分为2组：尿蛋白定性(-)、波动于(-) ～ (±)或偶因感染、剧烈运动后为+～++但感染控制或休息后尿蛋白消失者为无/间歇性蛋白尿组(13例)，尿蛋白持续+或以上者为持续性蛋白尿组(22例)。

2方法

GBM的测量：每例患者选取6～10个较完整的毛细血管袢。应用Image Pro-Plus软件测量毛细血管袢的GBM总长度及厚度，测量时避开系膜区不规则、扭曲的GBM。GBM宽度定义为内皮细胞膜至足细胞膜之间的距离[6]。不同年龄段GBM厚度参考范围参照文献[7]，分别测量变薄、增厚和撕裂分层的长度，计算出上述3个指标各占总长度的百分比。

足突宽度(foot process width，FPW)测量[1]：计数上述所选取的每个管袢的足突个数，根据公式计算平均FPW= π/4×(∑GBM长度/∑足突个数)；FPW定义为位于任何2个相邻滤过裂孔之间的上皮细胞片段。取6～10个毛血管袢FPW的平均值作为每例的平均FPW。

3统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行分析。资料的统计描述采用中位数(最小值,最大值)[median(minimum,maximum)]，两组比较采用Mann-Whitney非参数检验，两变量之间相关性分析采用Spearman检验。以P<0.05为差异有统计学差异。

结 果

12组AS患者GBM变薄、增厚和撕裂分层比较

持续性蛋白尿组GBM变薄、增厚和撕裂分层比例分别为0%(0%～37.9%)、52.6%(7.6%，100%)和24.9%(0%，100%)，无/间歇蛋白尿组GBM变薄、增厚和撕裂分层比例分别为0%(0%～19.4%)、31.8%(4.9%，64.2%)和0%(0%，80.9%)，其中前者GBM增厚和撕裂分层比例均较后者高(分别为P<0.05，P<0.01)，2组GBM变薄比例差异无显著。不同性别患者之间GBM变薄、增厚及撕裂分层比例差异无显著，见表1。

表12组AS患者GBM增厚、分层撕裂程度、足突宽度及肾活检年龄比较分析

Table 1. The median percentage of GBM attenuation, thickening, splitting and layering, and renal biopsy age in the two groups[median(minimum,maximum)]

GroupAttenuationThickeningSplittingandlayeringFootprocesswidth(nm)Age(year)Non-/intervalproteinuria0%(0%,19.4%)31.8%(4.9%,64.2%)0%(0%,80.9%)771(465,1412)5.92(1.17,10.00)Persistentproteinu-ria0%(0%,37.9%)52.6%*(7.6%,100%)24.9%**(0%,100%)1400**(787,4202)9.63**(2.08,24.00)

*P<0.05,**P<0.05vsnon-/interval proteinuria.

22组AS患者FPW比较

无/间歇蛋白尿组平均FPW为771 nm(465 nm，1 412 nm)，持续性蛋白尿组平均FPW为1 400 nm(787 nm，4 202 nm)。持续性蛋白尿组患者平均FPW较无/间歇蛋白尿组足突宽度大(P<0.01)。不同性别患者之间平均FPW无统计学意义，见表1。

3平均FPW与GBM变薄、增厚和撕裂分层比例的相关性分析

35例AS基底膜变薄比例0%～37.9%，增厚比例4.9%～100%，致密层撕裂分层比例0%～100%，足突宽度为465～4 202 nm。平均FPW与GBM增厚和撕裂分层比例均呈正相关(分别为r=0.556和r=0.715,均P<0.01)，而GBM变薄比例与FPW无明显相关(r=0.155,P>0.05)。

42组AS年龄分布比较

持续性蛋白尿组肾活检年龄较无/间歇蛋白尿组大(P<0.01)，见表1。

讨 论

AS是GBM的IV型胶原遗传缺陷所致[1]，GBM形态在疾病早期并无明显的改变，随着疾病进展可出现特征性增厚、变薄、厚薄不均、致密层撕裂分层[8]。AS早期可只表现为血尿，蛋白尿是AS疾病进展的重要危险因素[3]，但其发生机制目前尚未十分清楚。正常情况下血浆蛋白可以通过肾小球内皮细胞窗孔和GBM，但在足突裂孔膜处受到阻滞，提示裂孔膜是血浆蛋白滤过的主要屏障[5]。对IV型胶原COLA3敲除的AS小鼠研究发现，4周龄前，肾小球足突裂孔膜形态和结构无异常改变，小鼠无明显蛋白尿；第5周出现蛋白尿，足突融合，裂孔膜消失及裂孔膜蛋白表达改变，提示AS小鼠尿蛋白的发生主要与足突融合和裂孔膜损伤有关[9]。本研究结果显示AS足突损伤程度(足突宽度)与尿蛋白量呈正相关[1]。提示AS蛋白尿的发生与足突损伤有关，但AS患者GBM成分异常是如何导致足突损伤的，目前仍不清楚。

有研究发现，在AS小鼠模型，AS基底膜早期改变是异常层黏连蛋白积聚，导致GBM局部增厚，足突消失下方及增厚的GBM区域对转铁蛋白的通透性最高[3]。White等[6]研究发现，蛋白尿严重的AS患者GBM增厚的范围大，提示蛋白尿的滤出主要在GBM增厚部分。本研究结果显示持续性蛋白尿组GBM损伤范围及足突融合程度较无/间歇性蛋白尿组大，且足突融合程度与GBM损伤范围呈正相关。提示AS足突损伤与GBM改变有关，且有可能是继发于后者的改变。因此，推测AS基底膜异常有可能是通过引起足突损伤导致蛋白尿发生的。但有关GBM异常与足细胞之间的相互作用机制有待于分子水平更为深入的研究。

此外，本研究发现AS的GBM变薄范围与足突融合程度及蛋白尿无明显相关，提示变薄可能不是反映GBM损伤程度的敏感指标。本研究结果还显示持续性蛋白尿组肾活检年龄较另一组大，提示持续蛋白尿与患者年龄增长及疾病进展有关，能在一定程度上反映疾病严重程度和预示疾病的进展。

综上所述，AS足突损伤与GBM损伤程度以及蛋白尿水平相关，GBM异常有可能是通过影响足突的结构和功能导致蛋白尿发生的，但其机制仍需进一步研究。阐明AS蛋白尿的发生机理，将有助于揭示其肾小球损害进展的机制，为AS治疗提供新思路和理论依据。

[1] 管 娜，丁 洁，王素霞，等. 足细胞与Alport综合征蛋白尿的关系[J]. 中华肾脏病杂志,2010,26(10):748-752.

[2] Gubler MC. Inherited diseases of the glomerular basement membrane[J]. Nat Clin Pract Nephrol,2008,4(1):24-37.

[3] Abrahamson DR, Isom K, Roach E, et al. Laminin compensation in collagen alpha3(IV) knockout (Alport) glomeruli contributes to permeability defects[J]. J Am Soc Nephrol,2007,18(9):2465-2472.

[4] 梁 燕，程 静，黄海长. 足细胞损伤与肾小球疾病[J]. 中国病理生理杂志,2005,21(9):1864-1866.

[5] Gagliardini E, Conti S, Benigni A, et al. Imaging of the porous ultrastructure of the glomerular epithelial filtration slit[J]. J Am Soc Nephrol,2010,21(12):2081-2089.

[6] White RH, Raafat F, Milford DV, et al. The Alport nephropathy: clinicopathological correlations[J]. Pediatr Nephrol,2005,20(7):897-903.

[7] Haas M. Alport syndrome and thin glomerular basement membrane nephropathy: a practical approach to diagnosis[J]. Arch Pathol Lab Med,2009,133(2):224-232.

[8] Gong W, Liu Z, Chen H, et al. Spectrum of clinical features and type IV collagen α-chain distribution in Chinese patients with Alport syndrome[J]. Nephrol Dial Transplant,2006,21(11): 3146-3154.

[9] Hamano Y, Grunkemeyer JA, Sudhakar A, et al. Determinants of vascular permeability in the kidney glomerulus[J]. J Biol Chem,2002,277(34):31154-31162.

RelationshipbetweenultrastructurallesionsofglomerularfiltrationbarrierandproteinuriainAlportsyndrome

WANG Hai-yan1, SUN Liang-zhong1, WU Jin-lang2, JIANG Xiao-yun1, MO Ying1,TONG Hua-juan1

(1DepartmentofPediatrics,theFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofElectronMicroscope,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:sunlzh@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To explore the relationship between the ultrastructural lesions of glomerular filtration barrier (GFB) and proteinuria in Alport syndrome (AS).METHODSThirty-five AS patients (24 males and 11 females), who were admitted to our hospital from 2008 to 2012, were enrolled in this study. The median age was 6 years (1.17 ～ 24 years) according to the time of renal biopsy. The data of clinical and electron microscopic examination were collected for retrospective analysis. The patients were divided into 2 groups according to the degree of urinary protein: non-/interval proteinuria group (13 cases) and persistent proteinuria group (22 cases). The length of glomerular basement membrane(GBM) attenuation, thickening, and dense layer splitting and layering was measured, and the percentages of these lesions were calculated. The foot process width (FPW) was measured according to the formula average FPW=π/4× (∑ GBM length/∑ foot process number). The differences of the ultrastructural lesions in GFB between the 2 groups were compared, and the association between GFB ultrastructural lesions and proteinuria were analyzed.RESULTSThe percentages of GBM thickening, splitting and layering were higher, and the foot processes were wider in persistent proteinuria group than those in non-/interval proteinuria group. The median age at renal biopsy in persistent proteinuria group was older than that in non-/interval proteinuria group. The average FPW of the 35 patients was positively correlated with the percentage of GBM thickening, splitting and layering, and the age at biopsy, respectively.CONCLUSIONThe severity of GBM lesions is associated with the severity of foot process damage and the severity of proteinuria, suggesting that foot process damage associated with proteinuria in AS may be secondary to GBM lesions.

Alport syndrome; Glomerular basement membrane; Podocytes; Proteinuria

R322.6+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.02.031

1000- 4718(2013)02- 0361- 03

2012-08-31

2012-11-01

广东省自然科学基金资助项目(No.S2012010009405)；广东省科技计划(No.2011B031800126);高校基本科研业务费中山大学青年教师培育项目(No.09ykpy40)

△通讯作者 Tel:020-87755766-8310;E-mail:sunlzh@mail.sysu.edu.cn