不同强度电针对肥胖大鼠附睾脂肪细胞内质网应激的影响*

郜 婕， 唐成林， 刘仁建， 陈晓琳， 谢 辉， 余 敏， 刘祖丽

随着研究者对肥胖机制研究的推进，国际上对 肥胖成因的研究已处于分子生物学水平。肥胖常伴随炎症性因子的表达增加、脂肪组织代谢紊乱及瘦素、胰岛素抵抗等病理改变。新近研究发现，内质网应激－未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)能够与细胞内炎症反应信号转导通路偶联，是非感染性致病源引发炎症反应的主要原因［1］。内质网是合成细胞内分泌蛋白和膜蛋白并进行蛋白折叠的主要器官，它对维持细胞功能和机体内环境稳态具有重要意义。现阶段对肥胖的研究大多停留在肥胖基因调控、脂肪组织代谢及炎症因子表达［2］，鲜见对脂肪组织内质网应激反应的研究。而对内质网应激状态的监测是判断脂肪细胞是否恢复正常生理功能的关键，可能成为肥胖治疗效果的重要依据。之前的研究中我们证实，电针能调节C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、白细胞介素 6(interleukin 6，IL-6)、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、脂肪组织巨噬细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)等炎症因子的表达［3－4］，改善脂肪组织代谢［5］。本研究通过观察UPR信号转导通路中几种信号分子的改变，探讨电针对内质网应激的治疗作用。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 健康清洁级6周龄雄性SD大鼠60只，体重190～210 g，由重庆医科大学实验动物中心提供(医学动物合格证SCXK渝20050002)。

1.2 主要试剂与仪器 Bcl-2和caspase-12 ELISA试剂盒(R＆D公司分装);Ⅰ抗:p-PERK抗体和CHOP/GADD153抗体(北京博奥森);Ⅱ抗:辣根过氧化物标记生物素(北京博奥森);BCA蛋白定量试剂盒250次(上海贝博);酶标仪(Biocell，中国);电泳仪(DYY-6C，中国北京六一仪器厂);Chem Gel-DocXR凝胶成像分析系统(Bio-Rad);华佗牌针灸针(0.25 mm×13 mm，中国苏州医疗用品厂有限公司);恒明牌HM6805-1经络治疗仪(四川恒明科技开发有限公司)。

2 方法

2.1 单纯性肥胖大鼠模型制备及分组 健康清洁级雄性SD大鼠60只，6周龄，体重190～210 g。25℃左右恒温环境中适应性喂养1周后，随机数字表选取10只大鼠饲以普通饲料，为普食组(common diet group，n=10)，其余50只饲以高脂饲料，为模型组(model group，n=50)。饲料配方参考文献［6］提供的肥胖大鼠造模方法并略加改进:基础饲料67%、猪油5%、蔗糖5%、奶粉5%、花生5%、鸡蛋10%、麻油1%、食盐2%。每周各组大鼠称重1次，测体长1次。10周后，以体重超过普食组大鼠体重均数20%以上为肥胖大鼠纳入标准，在模型组中得到肥胖大鼠33只，从中筛选30只为高脂饮食(high-fat diet，HFD)组、5 mA 电针(5 mA electroacupuncture，5 mA EA)组和 1 mA 电针(1 mA electroacupuncture，1 mA EA)组，每组10只。普食组继续普食喂养，高脂饮食组与两电针组继续高脂饲料喂养。

2.2 治疗方法 每天上午9:00将各组大鼠固定于自制固定器上。两电针组选取双侧足三里(ST 36)和三阴交(SP 6)进行针刺，毫针匀速进针，直刺5 mm，接通电针。每天1次，每次15 min，连续治疗2周。穴位定位参照李忠仁《实验针灸学》［7］大鼠穴位的定位方法。电针参数:疏密波，频率20 Hz，强刺激电针组选用5 mA，弱刺激电针组选用1 mA。电针参数的选择依据近年来不同电针参数实验的研究文献。文献报道中大多把电针刺激强度分为3等:弱刺激(≤2 mA)、中等刺激(2～4 mA)和强刺激(≥5 mA)［8］。本实验选用1 mA(弱刺激)与5 mA(强刺激)作为对照观察。普食组与对照组不进行电针治疗，但同时进行固定，排除大鼠应激等因素导致的实验偏倚。

2.3 检测指标

2.3.1 大鼠体重检测及日常行为活动观察 每周五下午由固定人员测各组大鼠的体重，实验前后观察大鼠摄食量、饮水量、大小便、精神及活动情况。

2.3.2 ELISA检测大鼠附睾脂肪组织中Bcl-2及caspase-12的含量 应用双抗体夹心法，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。100 mg大鼠附睾脂肪组织加入pH 7.4 PBS 1 mL，匀浆器将标本充分匀浆。以3 000 r/min离心20 min，收集上清。稀释标准品，设空白对照孔，在酶标包被板待测样品孔中加样品稀释液与待测样品，37℃温育30 min，然后每孔加配置洗涤液洗涤5次，加酶标试剂，37℃温育30 min，洗涤5次。加入显色剂，37℃避光显色15 min，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(A)，空白孔调零，通过标准曲线计算脂肪组织样品中大鼠Bcl-2和caspase-12的含量。

2.3.3 Western blotting检测大鼠附睾脂肪组织中p-PERK和CHOP/GADD153表达 将100 mg大鼠附睾脂肪组织剪碎，加入0.2 mL RIPA和2 μL PMSF，用匀浆器于冰上充分匀浆。在冰上裂解30 min后，移入离心管，4℃、20 000×g离心30 min，然后将上清液转移到1.5 mL离心管中，BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品和样品缓冲液以4∶1的比例混合，沸水浴5 min。蛋白上样量均为40 μg总蛋白，10%的SDS-PAGE电泳，电转膜仪转移至NC膜，用丽春红染色液对膜进行染色，有条带则继续下一步实验。将膜置于5%的脱脂牛奶封闭液中，于摇床上封闭1 h，PBST漂洗3次;加入Ⅰ抗，4℃孵育过夜，取出Ⅰ抗，PBST漂洗3次，每次10 min;加入辣根过氧化物标记的Ⅱ抗，摇床轻摇1 h，TBST室温脱色摇床上洗3次，每次10 min;将膜置入发光盘中，加入发光试剂(ECL)进行化学发光反应，然后用胶片曝光、显影、定影，凝胶成像仪进行扫描分析，以目的条带和内参照条带的灰度比值代表p-PERK和CHOP/GADD153在脂肪组织中的表达水平。

3 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，多组之间均数的两两比较采用最小显著差异t检验(LSD-t)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 电针对SD大鼠体重的影响

如表1所示，2周后，高脂饮食组与普食组相比，高脂饮食组大鼠体重仍超过普食组大鼠体重的20%，与之前一样为肥胖大鼠。而电针组与高脂饮食组相比，电针组大鼠体重明显低于高脂饮食组，提示电针在减轻肥胖大鼠体重上效果确切。两电针组间比较，5 mA EA效果优于1 mA EA，提示电针刺激强弱对减轻体重影响不同，5 mA EA优于1 mA EA。

表1 体重比较Table 1.Comparison of body weight of the rats among the 4 groups before and after treatment(g.Mean ± SD.n=10)

2 电针对肥胖大鼠附睾脂肪组织Bcl-2和caspase-12蛋白含量的影响

如表2所示，高脂饮食组大鼠Bcl-2和caspase-12表达明显高于普食组(P＜0.01)，提示大鼠肥胖时，脂肪组织中Bcl-2和caspase-12的表达明显增加;在电针治疗后5 mA电针组和1 mA电针组与高脂饮食组相比Bcl-2和caspase-12的表达都有明显下降(P＜0.01)，提示电针对肥胖大鼠 Bcl-2和caspase-12表达的增加有一定抑制作用。两电针组Bcl-2的表达无显著差异(P＞0.05)，与普食组相比仍较高(P＜0.05)。5 mA电针组caspase-12的表达显著低于1 mA电针组(P＜0.05)，且与普食组相比无显著差异(P＞0.05)，而1 mA电针组caspase-12的表达仍高于普食组(P＜0.05)，提示1 mA电针对caspase-12表达的影响较5 mA电针弱，治疗效果较5 mA电针差。

表2 各组大鼠脂肪组织Bcl-2和caspase-12蛋白含量比较Table 2.Comparison of the content of Bcl-2 and caspase-12 in rat epididymal adipose tissues among the 4 groups(ng/L.Mean±SD.n=10)

3 电针对肥胖大鼠附睾脂肪组织中p-PERK和CHOP/GADD153表达水平的影响

高脂饮食组附睾脂肪组织中p-PERK和CHOP/GADD153表达明显高于普食组(P＜0.01);与高脂饮食组比较，电针治疗后，两电针组附睾脂肪组织中p-PERK和CHOP/GADD153表达显著降低(P＜0.01);5 mA电针组附睾脂肪组织中p-PERK和CHOP/GADD153表达又明显低于1 mA电针组(P＜0.05)，见图1。

讨 论

最近，内质网应激作为引发慢性炎症的可能机制已受到广泛关注。肥胖时，能量营养过剩和细胞压力改变激发内质网应激，通过UPR信号通路即能直接引起炎症［9］。内质网应激及其相关的信号通路成为炎症和代谢疾病相互作用的潜在作用点［10］。

目前我们发现UPR信号转导通路有3条:需肌醇酶1α信号通路、PERK信号通路和活化转录因子6信号通路［11］。这些信号转导通路与肥胖诱导的炎症信号通路有许多交点，包括 JNK-AP1和 NF-κBIKK通路的激活，ROS和NO的产生［12］。另外，内质网应激和炎症的关联也不是单方面的。炎症因子的激活，也能加重内质网功能的损害，由此使机体处于恶性循环之中［13］。以内质网为靶标的“细胞器治疗”方法为肥胖及代谢疾病治疗提供了新思路。

Figure 1.Comparison of expression of p-PERK and CHOP in rat epididymal adipose tissues among the 4 groups.1，2:common diet(CD)group;3，4:high-fat diet(HFD)group;5，6:5 mA electroacupuncture(5 mA EA)group;7，8:1 mA electroacupuncture(1 mA EA)group.Mean ± SD.n=10.＊＊P ＜ 0.01 vs CD group;△△P＜0.01 vs HFD group;##P ＜0.01 vs 5 mA EA group.图1 各组大鼠脂肪组织p-PERK和CHOP的表达

PERK是内质网膜上的一个跨膜蛋白分子，静息状态下与分子伴侣蛋白BiP相结合，以无活性的蛋白复合体存在。在内质网应激出现时，分子蛋白BiP与非折叠或错误折叠的蛋白多肽结合而使蛋白复合体解体，形成有活性的p-PERK［14］。p-PERK是内质网应激的典型产物，通过观察细胞中p-PERK的含量可判断细胞内质网的状态。CHOP/GADD153、Bcl-2和caspase-12是细胞在内质网应激过强或过长时间下由 UPR引起细胞凋亡路径中的信号分子［15］。CHOP/GADD153、Bcl-2和caspase-12的高表达提示细胞内质网应激已不能维持细胞功能，细胞开始死亡或凋亡［16］。

本研究显示，高脂饲料喂养的大鼠附睾脂肪组织p-PERK的表达及凋亡信号分子CHOP/GADD153、Bcl-2和caspase-12的含量较普食组显著升高，证实了肥胖与内质网应激的关联性。电针治疗后，p-PERK、CHOP/GADD153、Bcl-2 和 caspase-12的含量较高脂饮食组明显下降，5 mA EA优于1 mA EA，表明我们之前设想的电针对内质网的治疗作用是正确的。其中，我们发现，5 mA EA各项指标中除p-PERK较普食组含量高61.29%，其余指标均能恢复正常水平，提示电针抑制了内质网应激引起的细胞凋亡，此时虽还存在内质网应激，但程度较弱，细胞可以维持正常的功能。

由于内质网应激存在于多种疾病过程中，如糖尿病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、肿瘤等。本研究只是观察了肥胖中电针对内质网应激的影响，电针影响内质网应激的机制到底是直接的还是间接的，是否对其它疾病中存在的内质网应激也有治疗作用尚不清楚，还有待进一步研究。

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