黄酒对同型半胱氨酸诱导的大鼠血管内皮细胞基质金属蛋白酶2表达的影响*

季 政， 郭航远△， 池菊芳， 翟小亚， 刘龙斌，3， 孙 荷， 彭 放

血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)均为参与动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发生发展的重要细胞。绝大多数心血管危险因素会引起内皮功能障碍，且是最早可在AS演变中探测到的血管病变，与未来的心血管事件也密切相关［1］。内皮功能障碍首先主要表现为一氧化氮(nitric oxide，NO)合成下降，而NO能抑制血小板黏附、聚集及白细胞迁移入血管壁，抑制平滑肌细胞增殖等AS发生发展中的关键事件［1］。Chen 等［2］发现在血管内皮细胞中，NO通过活化转录激活因子3(activating transcription factor 3，ATF-3)干扰p53结合到启动子区域，从而抑制基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的转录。

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是目前公认与冠状动脉，脑动脉中AS相关的一个重要的独立危险因素［3-4］。血浆Hcy升高涉及遗传、药物、营养等多方面，而维生素B12(vitamin B12，VitB12)与叶酸是Hcy代谢过程中必需的辅酶，缺乏将导致血浆总Hcy水平上升，分为轻度(15～30 μmol/L)、中度(30～100 μmol/L)和重度(＞ 100 μmol/L)。研究表明补充VitB6、VitB12和叶酸可降低其水平。

流行病学的研究显示过量饮酒有损健康，但经常少量、适度饮酒与心血管风险却始终呈负相关［5］。目前国内对黄酒的研究表明其具有抗氧化、降低血胆固醇水平和免疫调节等功效［6］，但有关黄酒对心血管系统的保护效应及潜在机制的研究仍十分有限。我们前期的体外实验表明黄酒能抑制Hcy诱导的大鼠VSMCs MMP-2的表达和活性［7］，体内研究表明黄酒和红葡萄酒能抑制低密度脂蛋白受体敲除(LDLR-/-)小鼠MMP-2表达和动脉粥样硬化斑块的形成［8］。鉴于VECs在AS发生发展中的重要作用，本实验主要研究对Hcy诱导的大鼠VECs MMP-2的表达和活性的影响及少量黄酒对其的抑制作用，并探讨黄酒可能的抗AS机制。

材料和方法

1 动物和试剂

SD大鼠(18 d)购自浙江省实验动物中心。酒精度12%的黄酒、酒精购自绍兴黄酒集团，酒精度12%的红葡萄酒购自法国Languedoc-Roussillon;M199培养基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA购自Gibco;Ⅰ型胶原酶、明胶和D-L-Hcy购自Sigma;血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)购自 PeproTech;内皮细胞培养基(endothelial cell medium，ECM)及生长补充因子(endothelial cell growth supplement，ECGS)购自 ScienCell;兔抗大鼠Ⅷ因子Ⅰ抗、Ⅱ抗购自上海基因科技公司;MTT购自Amresco;鼠尾胶原蛋白I型购自杭州生友生物;鼠抗MMP-2单克隆抗体购自Abcam;HRP兔/鼠通用型Ⅱ抗购自DAKO;其它免疫印迹相关试剂购自江苏碧云天;YM30蛋白浓缩膜购自Millipore;其它化学试剂均为进口或国产分析纯。

2 大鼠VECs的培养、分组和干预

参考Kobayashi等［9］并作相应改良，取18 d左右SD大鼠2只，乙醚麻醉后乙醇浸泡2 min消毒，迅速在超净工作台中分离得到光滑完整的大鼠胸腹主动脉，显微剪剪开主动脉内膜向下贴附在装有少量0.1%Ⅰ型胶原酶溶液的玻璃皿上，37℃静置消化30 min，1 000 r/min 离心 5 min 收集 VECs，0.2% 鼠尾胶原包被的6孔板中培养，3～4 d后，更换ECM，继续培养5～6 d可见90% 以上细胞汇合成单层。玻璃探针镜下刮除少量成纤维样细胞进行分离纯化，D-Hanks液洗涤后，胰酶消化传代。对原代及第2代细胞进行免疫细胞化学鉴定。取第2代细胞接种于50 mL底面铺鼠尾胶原的培养瓶中，加ECM完全培养基培养48 h，待细胞融合80%左右，换无血清ECM继续培养12 h，使细胞增长同步后接种在含10%FBS ECM的6孔板中，细胞计数，每孔加VECs 2×105个，台盼蓝染色镜下测得细胞存活率约98%。(1)Hcy对VECs MMP-2蛋白表达和上清液酶活性的影响:按 Hcy 浓度梯度分为 0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L 5 组，与VECs培养48 h，结合人体实际病理生理情况及实验敏感性选取Hcy最适刺激浓度;(2)取最适浓度Hcy(100 μmol/L)与 VECs 培养 24 h、48 h、72 h，选取Hcy最适刺激时间;(3)黄酒和红酒抑制Hcy诱导的MMP-2表达及活化:实验分为 control组、Hcy组(Hcy 100 μmol/L)、Hcy+ 黄酒组(Hcy 100 μmol/L，酒精度1.4%)、Hcy+红酒组(Hcy 100 μmol/L，酒精度 1.4%)和 Hcy+ 酒精组(Hcy 100 μmol/L，酒精度1.4%)，与VECs培养48 h后，收集上清液，裂解蛋白，用于后续实验。

3 MTT检测酒类干预适宜浓度

消化对数期的VECs，以3×107/L接种在96孔板含10%FBS的ECM中培养，边缘用无菌PBS填充，24 h后干预。根据预实验结果，酒类干预浓度介于 1% ～2% 之间，实验分为 control、Hcy、Hcy+1.0%、Hcy+1.2%、Hcy+1.4%、Hcy+1.6%、Hcy+1.8%和 Hcy+2.0%8 组，加入的 Hcy均为 100 μmol/L。每天换液，48 h后每孔加5 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，终止培养后吸掉培养液。每孔加入DMSO 150 μL，摇床振荡10 min，使结晶充分溶解，490 nm处测量各孔的吸光度(A)。每组设5个复孔，2个零孔(无细胞，其余同干预组)。

4 Western blotting检测

按照如下处理:(1)加入 0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L Hcy 与 VECs培养48 h;(2)加入Hcy(100 μmol/L)与 VECs培养24 h、48 h、72 h;(3)实验分 control组、Hcy 组(Hcy 100 μmol/L)、黄酒组 (Hcy 100 μmol/L，酒精度1.4%)、红酒组(Hcy 100 μmol/L，酒精度 1.4%)和酒精组(Hcy 100 μmol/L，酒精度 1.4%)，与 VECs培养48 h后，细胞蛋白裂解上清液以BCA法进行蛋白定量后，每道40 μg蛋白上样于(与5×上样缓冲液充分混匀后煮沸5 min，4℃ 12 000 r/min离心5 min)SDS-PAGE中恒压电泳，积层胶60 V，分离胶100 V。电泳结束后切下分离胶，湿转法100 V约1.5 h转移至PVDF膜上。电转结束后，取下膜后先用TBS洗涤3次，每次5 min。然后置于5%脱脂奶粉封闭液中37℃封闭1 h。将膜与封闭液稀释的Ⅰ抗4℃孵育过夜，TBST平摇洗膜3次，每次15 min，然后与相应的Ⅱ抗37℃孵育1 h。TBST洗膜3次，去除未结合的Ⅱ抗。ECL-Plus化学发光处理，于暗室中30 min内压片曝光，显影及定影后 Bio-Rad Quantity One 4.4软件定量扫描分析。

5 明胶酶谱法检测MMP-2在VECs上清液中的活性

分组及干预时间同上，收集细胞培养上清，低速离心(200×g)去除细胞碎片，上清用Millipore公司YM30蛋白浓缩膜处理后(1 500×g，4℃离心4 min)，与1/2体积的样品缓冲液混合均匀后将25 μg样品上样于含0.1%明胶的SDS-PAGE电泳。60 V稳压跑浓缩胶，90 V跑分离胶，当溴酚蓝迁移到分离胶下游边缘2 cm时停止电泳。将凝胶取出，用蒸馏水漂洗数次后，移入2.5%Triton X-100溶液中(20 mmol Tris-HCl，pH 8.0;150 mmol NaCl;5 mmol CaCl2;2.5%Triton X-100)摇床上50 r/min平摇 30 min×2次洗脱SDS。蒸馏水漂洗后，加入明胶酶缓冲液，在37℃恒温摇床中温育42 h。用考马斯亮蓝R250染色4 h，在脱色液中脱色1～2 h，至对照出现明显、清晰的负染酶带后用蒸馏水漂洗、拍照，并用Quantity One 4.4软件定量分析。

6 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件处理数据，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠VECs培养及鉴定

大鼠胸腹主动脉VECs分离纯化后培养，原代细胞8～10 d长满汇合后，形态学鉴定呈现典型的“鹅卵石”或“铺路石”征。细胞免疫化学鉴定原代和纯化后的第2代细胞特异性Ⅷ因子相关抗原，可见胞质中呈棕黄色阳性表达，经纯化后的第2代细胞未见明显阴性表达细胞。400倍镜下可见棕色Ⅷ因子相关抗原颗粒，见图1。

2 MTT确定酒类干预的适宜浓度

实验表明100 μmol/L Hcy对VECs活性无显著影响，随着干预组酒精浓度的上升VECs活性(A值)下降;3组酒类间同一干预时A值无显著差别，与Hcy组相比，干预浓度1.8%时黄酒和红酒组，VECs活性显著下降(均P＜0.01);干预浓度为1.6%时酒精组VECs活性显著下降(P＜0.01)。根据上述结果统一采用1.4%酒精浓度进行干预，见表1。

Figure 1.The primary culture and immunocytochemical staining of rat aortic vascular endothelial cells.A:a small amount of cells were observable 3 days later(×100).B:the cells were rapidly growing after replacing endothelial cell medium 6 days later(×100).C:the cells grew with the characteristic“cobblestone morphology”when reaching 90%confluence 9 days later(×100).D，E and F:the cells were immunostained with antibody of factorⅧ，the marker of endothelial cells.D:primary cells;E，F:passage 2 cells.E:×200;D，F:×400.The red arrow showed brown granules in the cytoplasm，indicating positive staining.图1 大鼠VECs原代培养及免疫细胞化学染色

表1 黄酒、红葡萄酒及酒精对大鼠VECs活性的影响Table 1.Effects of Chinese rice wine，red wine and ethanol on the viability of rat aortic VECs(mean±SD.n=5)

3 免疫印迹法检测MMP-2在VECs中的表达

Hcy能够促进VECs MMP-2蛋白的表达，呈现浓度与时间的依赖性。(1)50～500 μmol/L Hcy促进MMP-2蛋白表达上调，组间差异有统计学意义(P＜0.05 或 P ＜0.01)，见图 2。(2)Hcy(100 μmol/L)干预24、48、72 h均能促进MMP-2蛋白表达，以48 h最明显(P ＜0.01)，见图3。(3)与Hcy组比较，黄酒组和红酒组VECs MMP-2表达分别下降了29.1%和32.6%(P ＜0.05)，酒精组下降 5.3%(P＞0.05);与酒精组比较，黄酒组与红酒组MMP-2表达下降差异有统计学意义(P＜0.05);黄酒组与红酒组之间无显著差异(P＞0.05)，见图4。

Figure 2.Effects of Hcy at different concentrations on the expression of MMP-2 in VECs.VECs were treated with Hcy at different concentrations for 48 h，and the MMP-2 protein was examined by Western blotting assay.Mean ± SD.n=5.*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01 vs control(0 μmol/L Hcy);##P ＜ 0.01 vs 50 μmol/L Hcy;△P ＜0.05 vs 100 μmol/L Hcy.图2 不同作用浓度的Hcy对MMP-2蛋白表达的影响

4 明胶酶谱法检测MMP-2在VECs上清液中的酶解活性

50～500 μmol/L Hcy增强 MMP-2 的活性，组间差异有统计学意义(P ＜0.05或 P ＜0.01)，见图5。Hcy(100 μmol/L)干预24、48、72 h 均能促进 MMP-2活性增强，以 48 h最明显(P＜0.01)，见图 6。与Hcy组相比，MMP-2活性黄酒组和红酒组分别下降31.2%和33.8%(P ＜0.05)，酒精组下降4.6%(P ＞0.05);黄酒组和红酒组MMP-2活性下降与酒精组相比差异有统计学意义(P＜0.05);黄酒组与红酒组之间无显著差异(P＞0.05)，见图7。

讨 论

Figure 3.Effects of Hcy treatment for different time on the expression of MMP-2.VECs were incubated with 100 μmol/L Hcy for 24 h，48 h and 72 h.Mean ± SD.n=5.＊＊P ＜0.01 vs control(0 h);##P ＜0.01 vs 24 h.图3 Hcy作用不同时间对MMP-2蛋白表达的影响

Figure 4.Effect of rice wine on expression of MMP-2 stimulated by Hcy(100 μmol/L，48 h)in cultured VECs.The MMP-2 expression was analysed by Western blotting and normalized with β-actin.Mean ± SD.n=5.＊＊P ＜0.01 vs control;△P ＜0.05 vs Hcy;#P ＜0.05 vs Hcy+ethanol.图4 黄酒对Hcy刺激下VECs MMP-2表达的影响

Figure 5.Effects of different concentrations of Hcy on the activity of MMP-2.VECs were treated with Hcy at different concentrations for 48 h，the MMP-2 activity was examined by gelatin zymography assay.Mean ± SD.n=5.*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control(0 μmol/L Hcy);△△P ＜0.01 vs 50 μmol/L Hcy;##P ＜ 0.01 vs 100 μmol/L Hcy.图5 不同浓度Hcy对MMP-2活性的影响

Figure 6.Effects of Hcy treatment for different time on the activity of MMP-2.VECs were treated with 100 μmol/L Hcy for 24 h，48 h and 72 h.Mean ± SD.n=5.＊＊P ＜0.01 vs control(0 h);△△P ＜ 0.01 vs 24 h.图6 Hcy作用不同时间对MMP-2活性的影响

Figure 7.Effect of rice wine on the activity of MMP-2 stimulated by Hcy(100 μmol/L，48 h)in cultured VECs.The MMP-2 activity was analysed by gelatin zymography.Mean ±SD.n=5.＊＊P ＜0.01 vs control;△P ＜0.05 vs Hcy;#P ＜0.05 vs Hcy+ethanol.图7 黄酒对Hcy刺激下VECs MMP-2活性的影响

基质金属蛋白酶(MMPs)是一类锌离子依赖的蛋白水解酶，能裂解几种细胞外基质成份，如胶原蛋白、酪蛋白、明胶等，参与调节细胞外基质的降解和重建［10-11］。其中以MMP-2分布最广，主要负责降解Ⅳ型胶原和变性胶原，并且 AS斑块的形成需要MMP-2介导的细胞外基质重建，其表达上升促进VSMCs增殖和迁移至血管内膜下，参与AS发生发展的过程。在正常血管中，VECs及VSMCs不断产生MMP-2［7，10-11］。对人类血管的研究表明，与正常区域相比MMP-2一般在脂纹和AS斑块处高表达，此外还显示，脂纹、出血和钙化的纤维粥样斑块以及完全闭塞的病变中富含MMP-2［10］。所有这些研究表明，MMP-2在AS病变的发生和进展中起着及其重要的作用。

Hcy增加心血管事件的风险与浓度相关，其通过一个涉及激活 MAPK和PI3K-Akt通路增强VSMCs中MMP-2的合成、分泌和活性。这表明Hcy直接参与导致斑块不稳定和重塑的机制。Bescond等［12］的研究表明 Hcy直接激活 proMMP-2可能是Hcy相关AS中参与ECM降解的机制之一。Hcy已被确认是AS的独立危险因子之一，国内外大量研究已经证实其可以通过多种机制引起血管内皮功能损伤和障碍，刺激MMP-2的表达，促进AS的发生［13］。本实验用不同浓度Hcy刺激体外培养的大鼠VECs，发现Hcy在50～500 μmol/L时呈浓度依赖性地促进MMP-2表达和增强其活性，在48 h时作用最明显(100 μmol/L)，这表明 Hcy可增强 VECs MMP-2 的表达和活性，促进AS的发生。血浆正常Hcy参考范围为5～15 μmol/L，参考人体实际病理生理情况(中、重度高Hcy血症≥100 μmol/L)及实验敏感性，选取100 μmol/L的Hcy作为刺激和造模浓度。

上世纪80年代有国外学者发现，尽管同样在日常饮食中摄入了大量的饱和脂肪酸，但法国民众心血管疾病发病率和死亡率却明显低于欧美其他国家，此即著名的“法国悖论”。1992年，Renaud等［14］经过研究后提出，法国民众爱饮红酒正是导致人群心血管事件发病率下降的主要原因，但具体机制未明。此后，大量对适量饮用红葡萄酒心血管保护作用机制的研究进一步阐明，其中富含的多酚是红酒发挥心血管保护作用的主要有效成分［15-16］，包括儿茶素、表儿茶素、没食子酸、阿魏酸、咖啡酸、花青素以及白藜芦醇等多种酚类［16］，具有改善血脂、调节血管内皮、改善内皮祖细胞功能、增加血管内皮NO的合成、抗凝、抑制VSMCs增殖和迁移以及抑制炎症因子等作用，能显著延缓甚至抑制粥样斑块的进展，最终可以有效减少心肌梗死等严重心血管事件的发生［15］，其在体外能显著抑制 MMP-2，MMP-9 在VSMCs的表达和激活，目前认为抑制MMP-2，MMP-9的表达可能是红酒心血管保护作用的机制之一［17］。由于红葡萄酒主要通过红酒多酚来抑制AS的进程，而黄酒同样富含多酚，其主要来自糯米和小麦，包括儿茶素、丁香酸、绿原酸、表儿茶素、阿魏酸、咖啡酸、没食子酸、p-香豆酸等9种酚类，总酚含量高达1.023 g/L，与红酒多酚在种类上几乎相同且在含量上不相上下［18］。因此我们推测，黄酒可能也是通过黄酒多酚来发挥其对AS病变的抑制作用。

目前国内谢广发等［18］的研究发现绍兴黄酒中不仅含有丰富的多酚类物质，还含有功能性低聚糖、B族维生素、生物活性肽类等多种有益心脑血管健康的成分。功能性低聚糖具有多种重要的生理功能，由于人体不具备分解此糖的酶系，在摄入后不易消化吸收，但它有利于肠道中双歧杆菌等益生菌的增殖，改善肠道的微生态环境，促进B族维生素的合成吸收。而研究证实VitB6和VitB12能显著降低血浆Hcy水平，我们在前期体内研究少量饮用黄酒对LDLR-/-小鼠MMP-2表达和AS斑块形成作用的影响实验中发现，黄酒组小鼠(高脂饲料+3%黄酒)血浆Hcy浓度较control组(高脂饲料+无菌水)、红酒组(高脂饲料+3%红酒)和酒精组(高脂饲料+3%酒精)显著下降［8］。这表明黄酒具有降低血浆Hcy浓度的功能，鉴于Hcy在AS及MMP-2合成分泌激活中的重要作用，提示我们小剂量黄酒可能通过降低血浆Hcy浓度从而起到对MMP-2表达和活性的抑制作用。本实验中与Hcy组相比，黄酒组和红酒组一样MMP-2蛋白表达和活性明显下降，酒精组MMP-2蛋白表达及活性尽管有所下降，但均无显著差异。这与Walter等［19］发现红葡萄酒对冠心病的保护效应可能涉及红酒多酚对MMP-2表达的抑制作用有关相一致，表明小剂量黄酒能抑制Hcy刺激下MMP-2表达的上升，说明黄酒也可能通过与红葡萄酒相类似的机制即酒精以外的保护性成分抑制了MMP-2的表达，起到对心血管系统的保护作用。以上结果都支持少量黄酒能抑制MMP-2表达和具有抗AS作用，并与前期研究的结论一致［7-8］。我们结合前期体内外实验推测，少量饮用黄酒对粥样斑块的抑制作用可能是通过降低血脂和血浆Hcy水平，进而抑制参与AS中的两种主要细胞 VECs和VSMCs中MMP-2的表达及其外分泌MMP-2的激活来实现的［7-8］，并且我们大胆推断黄酒可能也是通过一种与红葡萄酒极其相似的机制即黄酒中的黄酒多酚成分来发挥其对AS病变进程的抑制作用。针对黄酒多酚中具体单体成分抗AS作用的研究将在本系列实验的下一步中展开。

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