SORL1基因rs2070045单核苷酸多态性与遗忘型轻度认知功能障碍的关联分析

高 欣 于会艳 孙 亮 曾湘豫 刘 铭 杨 泽 高芳堃 秦 斌

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的神经系统变性性疾病。AD病因复杂，涉及到遗传、环境、代谢、病毒感染等多种因素。1991年，Goate A等发现早发家族性AD患者的21号染色体上淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）基因17号外显子发生了突变［1］，由此人们对AD的研究进入了分子遗传学这一崭新的领域，对AD患者相关致病基因的筛查已成为近20年来研究的热点。轻度认知功能障碍（mild cognitive impairment，MCI）是介于正常老龄和痴呆的过渡阶段，相当一部分MCI患者会进展为AD。尤其是遗忘型 MCI（amnestic mild cognitive impairment，aMCI），其以记忆损害为主要表现，Mayo老年痴呆研究中随访一组患者，证明在第6年时大约80%的aMCI患者已转化为AD［2］，而相应年龄的正常人群每年AD的发病率仅约1%～2%［3］，因此越来越多的学者注重于aMCI的研究，尤其是aMCI向AD转化的相关因素和生物学标记。2007年Rogaeva等首次提出分 拣 蛋 白 相 关 受 体 1（sortilin-related receptor1，SORL1，又称SORLA或LR11）基因可能是AD患病的第二风险因子，研究发现遗传性或获得性的SORL1受体表达或功能改变［4］，可能涉及AD发生的机制。目前对SORL1基因研究比较多的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是SNP19（rs2070045），Meta分析表明rs2070045携带G等位基因的人群患AD的风险大于携带T等位基因的人群［5］，但是SORL1基因rs2070045单核苷酸多态性在中国汉族aMCI人群中鲜有报道，本研究通过对aMCI患者SORL1基因rs2070045进行多态性检测，探讨该位点多态性与aMCI的相关性和风险。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究样本人群来自国家自然科学基金“社区老年人轻度认知障碍综合筛查模式的研究”课题。于2011年1月～2011年6月在北京某社区经筛查得到aMCI患者139例，男41例，女98例，平均年龄（74.5±5.7）岁，作为aMCI组；体检正常者213例作为对照组，男82例，女131例，平均年龄（69.4±7.1）岁。对照组与aMCI组性别、文化程度、生活背景等相互匹配，并确定为无血缘关系的健康者。

1.2 方法

1.2.1 诊断标准 aMCI诊断标准参见文献［6］并略作修改：（1）记忆障碍是基本和主要的主诉；（2）有记忆减退的客观检查证据，记忆障碍的客观检查低于同年龄及教育程度1.5个标准差以上；（3）一般认知功能正常，精神状态简易速查表（mini-mental state examination，MMSE）总分≥24分；（4）日常生活能力保留，日常生活能力量表（activities of daily living scale，ADL）＜26分（21项）；（5）无痴呆，临床痴呆评定量表（Clinical Dementia Rating，CDR）为0.5分，没有足够的认知障碍诊断为痴呆，不符合美国神经病学、语言障碍和卒中－老年性痴呆和相关疾病学会（NINCDS-ADRDA）的有关痴呆的诊断标准；（6）排除其他神经系统疾病和其他躯体疾病导致的记忆力下降；（7）经汉密尔顿抑郁量表（hamilton depression scale，HAMD）筛查排除抑郁状态；（8）Hachinski缺血评分：以≤4分排除血管性认知障碍。每个病例根据病史体检量表测试成绩，结合CT或MRI进行反复讨论分析，最后作出诊断。对照组为同期入组相匹配的正常对照者，均符合（1）无记忆力减退主诉，无严重躯体疾病，检查合作；（2）MMSE总分≥26分；（3）CDR＝0。排除标准：排除AD、血管性痴呆﹑帕金森氏性痴呆及脑器质性疾病所致的各种痴呆患者。排除正处于心血管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者，排除头部外伤史、特殊药物服用史等。两组间年龄性别差异不明显（P＞0.05）。

采用的神经心理学量表：精神状态简易速查表（mini-mental state examination，MMSE）、临床记忆量表（clinical memory scale，CMS）、临床痴呆量表（Clinical Dementia Rating，CDR）、日常生活行为量表（activities of daily living scale，ADL）、Hachinski缺血积分表（hachinski ischaemic scale，HIS）及汉密尔顿抑郁量表（hamilton depression scale，HAMD）。

1.2.2 静脉血采集 在受检者知情同意情况下，清晨取空腹静脉血5 ml，血样加EDTA抗凝剂后保存于－80℃冰箱中，用于DNA提取。

1.2.3 基因组DNA提取及定量取EDTA抗凝的受试者静脉血0.5 ml，用全基因组DNA提取试剂盒抽提DNA，通过蛋白／核酸比色仪对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，根据测定结果将样本DNA稀释至20μg／μl的工作液置于4℃冰箱。

1.2.4 位点选择 SORL1基因rs2070045（G／T）SNP多态性位点。引物序列分别为上游引物：5’-AACGACTGGA CGGACTGGT-3’，下游引物5’-CGGATGAGTGCTGTCAACTGAG-3’，扩增产物长度为78 bp。

1.2.5 PCR反应 PCR反应体系10μl，其中包含DNA模板1μl，10×PCR Buffer 1μl，10mmol／L dNTP0.2μl，Taq DNA 聚合酶（5 U／μl）0.2μl，rs2070045上下游引物（10 pmol／μl）各0.2μl，1×LC-green PLUS饱和荧光染料1μl，寡核苷酸内参0.2μl（高温寡核苷酸内参与低温寡核苷酸内参4个片段各0.05μl），去离子水补充总体积至10μl。PCR反应条件为95℃预变性5 min后进入主循环，95℃ 变性30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸6 s，总共45个循环，完成后72℃延伸7 min，之后进行HRM分析之前的变性和复性处理，程序为95℃30 s，25℃2 min，94℃30 s，24℃4 min。

表1 HRM－PCR的引物序列、退火温度及其产物长度

1.2.6 HRM检测 将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在 Lightscanner TMHR-I 96上进行HRM分析：从45℃开始，以0.3℃／s的斜率采集熔解曲线，到98℃结束，用Light-Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，判定基因型。

1.2.7 测序验证 根据HRM分析的不同曲线确定不同的基因型。从所得的不同基因型的个体中分别随机抽取5例样本进行测序验证。测序样本重新进 行 PCR 扩 增，上 游 引 物 为 5＇-CCGGAGTGACGAGTACAA-3＇，下 游 引 物 为 5＇-CTCGCTGATTTCTAAGGTCC-3＇，扩增片段长度为229bp。PCR反应体系30μl，包含 DNA 模板3μl，10×PCRBuffer 5μl，10mmol／L dNTP1μl，Taq DNA聚合酶（5 U／μl）1μl，上下游引物（10 pmol／μl）各0.6μl，去离子水补充总体积至30μl。PCR反应条件为95℃预变性5 min后进入主循环，95℃变性30 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸45 s，总共35个循环，完成后72℃延伸7 min。PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察合格后送华大基因测序部进行测序验证。

1.2.8 统计学处理 运用Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性。用比数比（OR）值及其95%置信区间（95%CI）来评价相对风险。实验数据中计量资料数据以±s表示，组间比较采用t检验，组间基因型频率及等位基因频率比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异显著性标准，采用SPSS 11.5软件。

2 结 果

2.1 SORL1基因rs2070045单核苷酸多态性的基因型分析 SORL1基因rs2070045单核苷酸多态性位点分为3种基因型：GG，GT，TT。通过HRM分型系统分析，可根据样本的熔解曲线差异，将所有样本分为3组基因型。3组之间的熔解曲线差异非常显著（图1）。每组中随机挑选5例样本进行测序验证，进行基因型的确定以及HRM分型结果准确性的评估。HRM分型的结果与测序的结果完全吻合，准确率为100%，测序图见图2。

2.2 SORL1基因rs2070045单核苷酸多态性的基因型与等位基因频率在aMCI患者和正常对照者中的分布 以Hardy-Weinberg平衡法检验aMCI组和正常对照组的基因型频率，等位基因的分布具有群体代表性（P＞0.05）。

SORL1 rs2070045单核苷酸多态性基因型及等位基因频率分布见表2，三种基因型频率在aMCI组和对照组间的分布有显著差异（χ2＝7.109，P＝0.029），两种等位基因频率在两组间的分布也有显著差异（χ2＝7.315，P＝0.007）。G等位基因为危险等位基因（OR＝1.528，95%CI为1.123～2.080），不同遗传模型下GG＋GT基因型与对照组有显著差异（OR＝1.873，95%CI为1.061～3.308），为危险基因型，GG纯合基因型与对照组也有显著差异（OR＝1.658，95%CI为1.053～2.612），为危险基因型（表3）。

图1 SORL1基因rs2070045单核苷酸多态性HRM分型的熔解曲线 红色代表TT基因型，蓝色代表GG基因型，灰色代表GT基因型

图2 SORL1基因rs668387单核苷酸多态性样本抽样测序图 （A图为GG型，B图为TT型，C图为GT型）

表2 SORL1基因rs2070045基因型和等位基因频率在aMCI组和对照组的分布［n（%）］

2.3 不同性别aMCI组与对照组SORL1 rs2070045基因型及等位基因频率比较 男性aMCI组与对照组SORL1基因型及等位基因频率分布无显著差异（表4），SORL1基因rs2070045不同遗传模型下基因型在男性aMCI组和正常对照组的分布无显著差异（表5），女性aMCI组与对照组基因型无显著差异但是等位基因频率分布有显著差异（表6），SORL1基因rs2070045不同遗传模型下基因型在女性aMCI组和正常对照组的分布无显著差异（表7）。

表3 SORL1基因rs2070045不同遗传模型下基因型在aMCI组和对照组的分布［n（%）］

表4 SORL1基因rs2070045基因型和等位基因频率在男性aMCI组和对照组的分布［n（%）］

表5 SORL1基因rs2070045不同遗传模型下基因型在男性aMCI组和对照组的分布［n（%）］

3 讨 论

认知障碍的病因及致病机制目前仍不十分清楚，研究表明，除少数家族性AD外，绝大多数AD都呈散发性。散发AD由多因素及多基因导致，目前诸多等位基因中得到广泛证实是晚发型AD的风险因子的有APOEε4［7］。2007年Rogaeva等首次提出SORL1可能是AD患病的第二风险因子［4］，但是对aMCI的遗传学研究仍然很局限，尤其是aMCI向AD转化的相关因素和生物学标记。由于缺乏aMCI有效的临床诊断方法，以及其发展的难以预测性，因此，以遗传学作为筛选aMCI易感人群的生物学标记物成为热点。如果能够发现与aMCI有关的致病基因，就有可能提高对aMCI的诊断，并作为预测aMCI病情发展的标记。从aMCI层面阐明和证实AD的易感基因，可以为AD患者的有效筛查、早期诊断、临床治疗和干预提供线索，具有重要的社会、经济和科学意义。

表6 SORL1基因rs2070045基因型和等位基因频率在女性aMCI组和对照组的分布［n（%）］

表7 SORL1基因rs2070045不同遗传模型下基因型在女性aMCI组和对照组的分布［n（%）］

SORL1基因位于人类11号染色体的长臂q 23.2-24.2区域，在神经细胞内表达，该基因编码的受体穿梭于质膜、内涵体和高尔基体，在神经元细胞中发挥转运作用。SORL1受体可以阻止APP形成Aβ，SORL1受体减少将导致脑内Aβ水平增高，从而导致AD的发生。自2007年Rogaeva等首先报道了对6个不同种群的SORL1基因序列中的单核苷酸多态性研究，关联分析表明SORL1基因的SNP与散发AD相关联，但也表现出不同种群的差异性［4］。在此之后，陆续有研究证实SORL1基因多态性与AD相关［8，9］，但也有部分研究显示无明显关联［10，11］。与AD相关的SNPs位于SORL1基因的两个区域，靠近SORL1基因5’端的SNPs 8-10和3’端的SNPs 19-25。我们选取了SORL1基因5’端 的 SNP 8（rs668387）和 3’端 的 SNP19（rs2070045）、SNP23 （rs3824968）和 SNP24（rs2282649）4个位点进行了研究，除了rs2070045位点的基因型和等位基因频率在aMCI人群和正常对照人群中有显著差异外，其余3个位点未见差异（结果未显示）。

SORL1基因rs2070045位点野生型基因型为TT，存在GG和GT两种变异基因型。SORL1基因多态性与aMCI的关联尚未见报道，本研究发现，aMCI人群GG，GT，TT三种基因型与正常对照人群三种基因型分布频率有显著性差异（P＜0.05），G等位基因频率在aMCI和正常对照有显著性差异（P＜0.01），为危险等位基因（OR＝1.528，95%CI为1.123～2.080），该位点G等位基因在女性中也是危险等位基因（OR＝1.501，95%CI为1.028～2.191）。本研究结果提示北京汉族人群SORL1基因rs2070045位点的G／T SNP多态性与aMCI关联，G等位基因是危险等位基因，并且该等位基因在女性人群也是危险等位基因。该位点在西方人群中研究发现，携带G等位基因的人群患AD的风险大于携带T等位基因的人群［5］；亚洲人群中日本人Kimura在晚发型AD人群研究中发现rs2070045位点G等位基因为风险等位基因［12］，上海晚发型AD人群中发现rs2070045位点的G等位基因为风险等位基因［13］，与本研究在aMCI人群中的发现一致，也就是说aMCI与AD具有相同的遗传背景，由于aMCI是AD的高危人群，说明从aMCI阶段预测其进展是可行的，可能对aMCI诊断和预测有帮助。

综上所述，本研究结果显示SORL1基因rs2070045位点G／T SNP多态性与aMCI相关联，并且在女性中得到了同样的结果，说明SORL1基因rs2070045位点单核苷酸多态性与aMCI相关，该位点G等位基因可能是aMCI的危险因素之一。但是在男性中没有看到相同结果，考虑可能与病例样本量少，分性别后导致样本量更少，或者是该危险因素与性别相关。由于aMCI人群具有向AD极高的转化率，因此从aMCI阶段寻找与患病相关的遗传因素，具有非常重要的意义。但是SORL1基因存在多个位点的SNP，并且有人群特异性，要明确该基因与aMCI的关系，还应选择更多位点进行更大规模人群的研究。

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