电针对骨癌痛模型大鼠下丘脑β－内啡肽的影响

赵文麟，赵文树，黄洪伟，仲丽丽

(1．黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040;2．上海龙华医院，上海200032;3．黑龙江省中医研究院，黑龙江 哈尔滨150001)

《素问·保命全形论》篇载:“凡刺之真，必先治神。”《灵枢·刺节真邪》亦谈:“用针之类，在于调气。”故对实验用动物采用电针“调气”，即调节机体的气血运行。本实验观察电针攒竹穴对骨癌痛大鼠所引起的下丘脑神经元结构中β－内啡肽(β－Endorphin，β－EP)含量的改变，说明电针对骨癌痛的影响和调节作用。

1 材料与方法

1．1 实验动物与分组

重70～80 g雌性Wistar大鼠1只，SD雌性大鼠40只，体重180～200 g，由山东省青岛市派特福德白鼠养殖专业合作社提供。购入后适应饲养1周，清洁饮水，自由摄食，每次行为实验前均进行环境适应性训练，以排除应激干扰。行为学测定时间在上午10点至下午2点之间。按随机数字表将SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、电针组，每组10只。

1．2 主要试剂与仪器

Walker256乳腺癌细胞株由中国协和医科大学提供，10%水合氯醛(武汉博士德生物工程有限公司)，Rabbit anti－β－EP试剂、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，JL－C2刺激器(与上海嘉龙教仪厂合作改装)，0．22 mm×13 mm针灸针(苏州东邦医疗器械有限公司)，YLS－3E电子压痛仪(山东省医学科学院设备站)，YLS－6B智能热板仪(济南益延科技发展有限公司)，韩氏电针仪LD202H(北京华卫公司)，Bx－600光学显微镜(上海仪圆光学仪器有限公司)，眼科手术器械、针、线、血管钳、镊子等。

1．3 模型制备

将1只重70～80 g雌性Wistar大鼠腹部注射入制备好的0．5 ml乳腺癌walker256细胞悬液(约2×107cells/ml)，约6～7天后，大鼠腹部明显膨隆时，抽取大鼠腹水制成2×104cells/ml的大鼠腹水瘤细胞悬液，置于冰上保存。对模型组和电针组SD大鼠左侧胫骨结节下外方与骨面呈45°朝尾侧进针，注入细胞悬液5 ul(1×105cells)，用无菌骨蜡封闭针孔。假手术组注入等量无菌生理盐水。空白组不做处理。

1．4 治疗方法

电针组在手术后8天开始治疗，取“攒竹”穴，参照人体穴位骨性标志对大鼠穴位定位，在大鼠的额骨近内眦前1/3处，内眶缘斜面向内眦方向平刺5 mm，以0．22 mm×13 mm的毫针进行针刺，双侧接电刺激器，频率:2/100 Hz，强度:0．3 mA。每次留针 13 min，每日1次，连续治疗6天，停1天，再连续治疗6天。

1．5 行为学测定

每日观察大鼠的皮毛、精神状态、步态以及对食物和水的摄入量、体重等是否有改变及改变的程度变化。

1．5．1 机械性痛敏(PWT) 各组于造模前用YLS－3E电子压痛仪测定鼠尾基础机械痛阈，并于造模5天开始隔天1次测量各组大鼠鼠尾机械性痛阈。

1．5．2 热痛敏(PWL) 各组于造模前使用YLS－6B智能热板仪测定基础热痛阈，造模5天开始隔天1次评价大鼠对热刺激的反应。

1．6 免疫组化测定

1．6．1 取材及染色 造模21天行为学测定完毕后，将大鼠断头，冰浴条件下迅速取脑组织后行固定、石蜡包埋、切片;HE染色、常规进行β－EP免疫组化法测定。

1．6．2 图像分析 BX－600光学显微镜下观察，每组选10张切片，每张切片选取3个视野，测量大鼠下丘脑β－EP样阳性纤维的光密度和颗粒面积。应用Image－Pro Plus 6．0光学分析软件进行分析，对不同组别下丘脑核团β－EP阳性纤维进行定量分析。

1．7 统计处理

实时定量数据用SPSS18软件进行分析，以平均值±标准差(¯x±s)表示，组间差异采用方差分析(ANOVA)，以P＜0．05作为显著性差异的标准。

2 结果

大鼠于造模8天左右逐渐出现皮毛不亮、喜卧、不喜动，偶尔出现间歇性跛行，食物摄入量较空白组大鼠减少，体重增加幅度减小。

2．1 机械痛敏(PWT)

造模9天起，模型组机械性痛敏与空白组、假手术组和电针组相比有显著性差异(P＜0．05);电针组与空白组、假手术组相比有显著性差异(P＜0．05)。各组大鼠机械性痛敏见图1。

2．2 热痛敏(PWL)

造模11天起，模型组热痛敏与空白组、假手术组和电针组相比有显著性差异(P＜0．05);电针组与空白组、假手术组相比有显著性差异(P＜0．05)。各组大鼠热痛敏见图2。

图1 各组大鼠机械性痛敏比较

图2 各组大鼠热痛敏比较

2．3 β－EP免疫组化

图4 各组大鼠β－EP免疫组化结果比较

从封三彩图3及图4可见各组大鼠下丘脑内β－EP阳性纤维的密度有所不同，脑内β－EP阳性纤维假手术组、电针组及模型组含量均高于空白组。空白组含量为0．21 ±0．05;假手术组含量为 0．37 ±0．04;电针组含量为 0．62±0．02;模型组含量为 0．69±0.03。其中模型组与空白组及假手术组比较差异性显著(P＜0.05)，电针组与空白组及假手术组比较差异性显著(P＜0．05);电针组与模型组比较差异性显著(P ＜0.05)。

3 讨论

本实验所得行为学结果与小鼠骨癌痛时间点有所区别［1］。β －EP 是机体的主要的内源性阿片肽［2］，在脑内主要分布在下丘脑、杏仁核等部位。它的主要功能是使机体在应激状态下保持平衡，主要调节疼痛、心血管和免疫功能［3］。β－EP经下丘脑垂体门脉系统进入血液中，参与体内多种生理活动，有疼痛、免疫、应激、抗心肌缺血［4］以及味觉嗜好［5］等。β － 内啡肽的镇痛作用较强，因此与镇痛作用的联系最紧密。

根据免疫组化法检测结果推测电针可能抑制大鼠脑内β－EP的释放，甚至可能抑制β－EP的合成，使脑内的β－EP样阳性纤维的密度减低，从而减少与脑内阿片受体的结合，以减轻癌症骨转移带来的疼痛。

癌症骨转移给患者带来的疼痛机制比较复杂，经研究表明与中枢神经系统的β－EP含量有关。出现骨转移疼痛时机体生理机能降低、微环境稳态失衡，因而出现各系统功能紊乱，β－EP在机体内的生物学效应较为广泛，其主要作用是针对应激时全身各系统的机能协调，起到调节机体的各种生理功能的作用，但其作用机制还需进一步研究。

通过本实验证明2/100 Hz电针可以抑制大鼠脑内因骨癌痛被激活的β－EP。使其与脑内阿片受体结合产生作用的机会减少，从而减轻β－EP对骨癌痛的作用。

骨癌痛时机体出现功能紊乱，β－EP在机体内主要作用是协调和统一应激时全身各系统的机能，它可 以调节机体的各种生理功能。

［1］ 任炳旭，马正良，靳艳卿，等．身痛逐瘀汤对骨癌痛小鼠痛行为及脊髓星形胶质细胞活化的影响［J］．中国中西医结合杂志，2011，31(3):381－385

［2］ 韩焱晶，代伟伟，彭磊，等．针刺对应激性胃黏膜损伤大鼠血浆和下丘脑中β－内啡肽含量的影响［J］．针刺研究，2011，36(5):341－346

［3］ 王世英．阿片肽研究的回顾和展望［J］．生物学通报，2001，36(1):5－7

［4］ 涂乾，王华，王亚文，等．电针内关穴后下丘脑室旁核、β－内啡肽及白细胞介素1的变化［J］．中国临床康复，2006，10(11):126－128

［5］ 马隽，刘丽萍，赵毅刚，等．味觉嗜好学习对大鼠下丘脑β－内啡肽表达及运动行为的影响［J］．河北体育学院学报，2007，21(4):9－11