针刺对血管性痴呆大鼠血清TNF－α、IL－1β及学习记忆能力的影响*

陈英华，孙忠人，金 弘，洪 霞，姜 磊，秦瑞奇，魏 巍，倪国忠

(1．黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040;2．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040)

血管性痴呆(Vascular dementia，VD)是指因脑血管病导致的痴呆临床综合征，以反复发生缺血性卒中事件后出现痴呆、认知功能突然减退或波动样、阶梯样进展为特点［1］，其患病率大约占脑卒中幸存者中的1/3［2］。病程中同时存在与痴呆有关的脑血管性损害表现，如局灶性体征和症状。该病最终导致患者的日常生活能力减退和社会活动能力逐渐丧失，严重影响着患者的生活质量，给患者及家庭、社会带来沉重负担［3－4］。目前尚无 VD满意的治疗药物和方法。VD的防治一直是医学界研究的热点问题。大量研究［5－7］表明，针刺疗法能够改善痴呆患者的记忆和生活能力。本研究在导师孙忠人教授的指导下，选择与学习记忆能力有内在联系的相关因子为切入点，采用四血管阻断法(4－VO)制作VD大鼠模型后，选取四神聪、风池穴进行针刺，观察VD大鼠的学习记忆能力及检测大鼠血清中TNF－α、IL－1β含量的变化，旨在探讨针刺防治血管性痴呆的作用机制，为针刺防治VD提供进一步的理论和实验依据。

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 动物 选用健康 SD雄性大鼠168只，2～3个月龄，体重(220±30)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。将大鼠放入Morris水迷宫中进行定位航行、空间探索学习训练，连续进行5天，第6天进行大鼠行为学检测，选择90 s内找到平台的大鼠备用，进行水迷宫测试的168只大鼠全部符合条件。

1．1．2 仪器 电子天平(PL602－L)，梅特勒 －托利多仪器(上海)有限公司;大鼠脑立体定位仪SN－2，日本;Morris水迷宫(直径150 cm，高60 cm;站台规格:直径12 cm，高25 cm)，中国医学科学院药物研究所;单极微手术电凝器(CHR)，武汉春光医疗美容仪器有限公司;自动平衡微型离心机(LD24－0．8)，北京医用离心机制造厂;电动玻璃匀浆机(DY89 1型，宁波);分析振荡器(FZQ 2型，江苏);脉冲电疗仪(KWD－808Ⅰ)，常州市武进长城医疗器械有限公司;摄像机(HDR－PJ200)，日本索尼公司;0．30 mm×13 mm“华佗牌”一次性针灸针，苏州医疗用品厂有限公司;Ht2型酶标仪和洗板机，奥地利博塞。

1．1．3 试剂 IL－1β、TNF－α 酶联免疫试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1．2 实验方法

1．2．1 动物分组 将168只大鼠随机分为正常组24只、假手术组24只，剩余的120只作为备用采用国际公认的Pulsinelli四血管阻断法(4－VO)制作VD大鼠模型。其中造模期间死亡48只，存活72只。将模型制作成功大鼠72只随机分为模型组、手针组、电针组，每组24只。共计5大组，每组分别于造模后7天、14天、21天又分为3个时间点，每个时间点各观察8只。

1．2．1 VD模型的建立 采用国际公认的Pulsinelli四血管阻断法(4－VO)制作 VD大鼠模型［8］。术前12 h禁食、禁水。以10%水合氯醛(0．4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，将大鼠伏卧固定于固定台上，消毒，行背侧颈正中切口，逐层钝性分离暴露双侧第1颈椎横突翼小孔，用直径为0．5 mm的电凝针插入每侧翼小孔烧灼双侧的椎动脉，造成永久性闭塞。在手术部位施以适量青霉素抗感染。24 h后再将大鼠麻醉，仰卧固定，消毒，行腹侧颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，以“4”号丝线穿线牵拉颈总动脉，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5 min，共夹闭3次，每次间隔1 h。术后手术部位施以适量青霉素对抗感染，然后缝合，常规饲养观察，每天每只肌肉注射青霉素8万U，连续7天，以防感染。

1．2．2 干预方法 ①正常组:不造模，不针刺。②假手术组:背侧颈正中切口，分离双侧椎动脉，不阻断血流;颈正中切口，分离双侧颈总动脉，不夹闭血管;抗炎后直接缝合，不针刺。③模型组:只造模，不针刺。④手针组:造模7天后即开始针刺，腧穴选取参照《实验针灸学》［9］取左右神聪、双侧风池穴。操作方法:用0．30 mm×13 mm华佗牌毫针针刺左右神聪穴，平刺2．5 mm，双侧风池穴，向后下方斜刺5 mm，持续捻转5 min后留针，针刺治疗每日1次，每次30 min。分别于治疗7天、14天、21天后3个时间点进行行为学及各观察指标测试。⑤电针组:造模7天后即开始针刺，选取左右神聪、双侧风池穴。具体方法:用0．30 mm× 13 mm华佗牌毫针针刺左右神聪穴，向百会平刺2．5 mm，双侧风池穴，向后下方斜刺5 mm，然后连接长城牌KWD－808Ⅰ型脉冲电疗仪，分别连接同侧的神聪穴、风池穴，正极在上，负极在下，施以连续波，电压2 V，频率为2 Hz，电流100 μA，强度以肢体微颤为度，针刺治疗每日1次，每次30 min。

1．2．3 行为学检测 通过Morris水迷宫检测大鼠的行为学习记忆能力。Morris水迷宫由圆形不锈钢的水池、平台、自动记录系统、供水系统四部分组成，水池直径150 cm，高60 cm，水深26 cm，水温保持在(24±1)℃，池壁标明4个等距离入水点，为试验起始点，由此将水池等分为4个象限，任选其中1个象限，正中放置1个直径12 cm、高25 cm的平台，迷宫上方装有摄像机，并和录像机以及计算机显示器连接，自动录入大鼠游泳轨迹进行分析。实验时以水面稍微漫过平台1 cm为宜。通过初筛，进行水迷宫测试的168只大鼠全部符合条件。并分别于造模前、造模后7天、针刺治疗第7天、第14天、第21天的时间点进行行为学测试。

1．2．4 大鼠血清TNF－α、IL－1β 含量测定 分别于针刺治疗第7天、第14天、第21天的3个时间点结束进行水迷宫测试完毕后，经心脏取血，静置2 h，2500转/min离心10 min，分离血清，置－20℃冰箱中备检。采用酶联免疫吸附法(Elise)进行IL－1β、TNF－α测定，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1．2．5 统计学方法 应用SPSS18．0软件包进行统计分析，所有数据以x¯±s表示。同一组内不同时间点采用单因素方差分析，不同组之间同一时间点比较采用t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 水迷宫实验结果

2．1．1 造模前后定位航行试验 造模前、后各组大鼠逃避潜伏期的比较，见表1。

表1 造模前、后各组大鼠逃避潜伏期的比较(¯±s，单位:s)

表1 造模前、后各组大鼠逃避潜伏期的比较(¯±s，单位:s)

组别 n 造模前 造模后正常组24 29．37 ±9．88 29．67 ±8．72假手术组 24 29．62 ±9．36 30．84 ±9．52模型组 24 29．09 ±9．99 42．54 ±6．11手针组 24 29．75 ±9．27 43．90 ±7．24电针组24 29．32 ±9．64 42．83 ±8．28

由表1可以看出，造模前各组大鼠定位航行试验逃避潜伏期无统计学差异(P＞0．05)，且有可比性;造模后模型组、手针组、电针组大鼠与正常组、假手术组对比逃避潜伏期明显延长，差异有显著性意义(P＜0.01)，说明VD大鼠造模成功。

2．1．2 造模前后空间探索试验 造模前、后各组大鼠穿越平台次数的比较，见表2。

表2 造模前、后各组大鼠穿越平台次数的比较(¯±s，单位:次)

表2 造模前、后各组大鼠穿越平台次数的比较(¯±s，单位:次)

组别 n 造模前 造模后正常组24 5．21 ±0．83 5．13 ±0．90假手术组 24 5．21 ±1．02 4．67 ±0．64模型组 24 5．17 ±1．20 2．50 ±0．59手针组 24 5．17 ±0．92 2．50 ±0．59电针组24 5．17 ±0．82 2．63 ±0．77

由表2可以看出，造模前各组大鼠空间探索试验穿越平台次数无统计学差异(P＞0．05)，且有可比性;造模后模型组、手针组、电针组大鼠与正常组、假手术组对比穿越平台次数明显减少，差异有显著性意义(P＜0．01)，说明VD大鼠造模成功。

2．1．3 治疗后各组大鼠不同时间点逃避潜伏期比较见表3。

表3 治疗后各组大鼠不同时间点逃避潜伏期比较(±s，单位:s)

表3 治疗后各组大鼠不同时间点逃避潜伏期比较(±s，单位:s)

注:与正常组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;与假手术组比较，★P ＜0．05，★★P ＜0．01;与模型组比较，▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01。

组别 n 7天 14天 21天正常组 8 28．93 ±9．10▲▲ 29．95 ±10．25▲▲ 31．54 ±8．62▲▲假手术组 8 30．00 ±9．98▲▲ 31．05 ±8．79▲▲ 31．47 ±10．96▲▲模型组 8 46．11 ±10．45＊＊★★54．01 ±13．21＊＊★★ 73．97 ±8．66＊＊★★手针组 8 40．56 ±8．30＊＊★ 38．22 ±4．60▲▲ 35．88 ±4．04▲▲电针组 8 38．30 ±4．70* 35．03 ±4．03▲▲ 30．65 ±3．70▲▲

由表3可以看出，针刺治疗后，与同一时间点的模型组相比，手针组、电针组大鼠逃避潜伏期明显缩短，差异有显著性意义(P＜0．01);同一时间点，电针组较手针组的逃避潜伏期明显缩短，差异无统计学意义(P＞0．05)。说明针刺可以改善VD大鼠的学习记忆成绩，电针组显著。

2．1．4 治疗后各组VD大鼠不同时间点穿越平台次数的变化比较 见表4。

表4 治疗后各组VD大鼠不同时间点穿越平台次数的变化比较(¯x±s，单位:次)

由表4可以看出，针刺治疗后，与同一时间点的模型组相比，手针组、电针组大鼠穿越平台次数明显增 多，差异有显著性意义(P＜0．05或P＜0．01);与同一时间点的手针组相比，电针组大鼠的穿越平台次数明显增多，差异有显著性意义(P＜0．05)。说明针刺可以改善VD大鼠的学习记忆成绩，电针组更为显著。

2．2 治疗后各组大鼠不同时间点血清TNF－α、IL－1β含量变化比较

表5 治疗后各组大鼠血清TNF－α含量变化(¯±s，n=8，单位:ng/L)

表5 治疗后各组大鼠血清TNF－α含量变化(¯±s，n=8，单位:ng/L)

注:与正常组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;与假手术组比较，★P ＜0．05，★★P ＜0．01;与模型组比较，▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01。

组别 7天 14天 21天正常组 16．77±1．65▲▲ 16．77 ±1．65▲▲ 16．77±1．65▲▲假手术组18．20 ±2．76▲▲ 18．45 ±2．37▲▲ 18．39 ±2．36▲▲模型组 31．43 ±3．21＊＊★★ 34．05 ±4．54＊＊★★ 42．36 ±3．74＊＊★★手针组 22．89±3．26＊＊★★▲▲23．85 ±2．46＊＊★★▲▲22．94±3．44＊＊★★▲▲电针组 20．99 ±2．56＊＊★▲▲ 20．88 ±3．26＊＊▲▲ 22．92 ±3．76＊＊★★▲▲

由表5可以看出，针刺治疗后，同一时间点的手针组、电针组大鼠血清TNF－α含量明显下降，与模型组相比较，差异有显著性意义(P＜0．01)。说明针刺可以降低VD大鼠的TNF－α含量，电针组较显著。

表6 治疗后各组大鼠不同时间点血清IL－1β含量变化(¯x±s，n=8，单位:ng/L)

由表6可以看出，针刺治疗后，同一时间点的手针组、电针组大鼠血清IL－1β含量显著降低，与模型组相比较，差异有显著性意义(P＜0.01)，说明针刺可以降低VD大鼠的IL－1β含量，电针组较显著。

3 讨论

由于大鼠的脑血管分布与人类酷似，国内外常采用SD大鼠或Wistar大鼠，利用二血管阻断法(2－VO)、三血管阻断法(3－VO)或四血管阻断法(4－VO)建立VD动物模型。虽然4－VO手术较复杂，在预实验中4－VO死亡机率较高，但实验操作的熟练程度直接影响实验结果［10］。由于4－VO为目前国际公认的VD造模方法，它可高度模拟VD的发病特点，且缺血后生理指标稳定，不影响缺血后结果，病理改变较为充分、明确，无明显肢体运动障碍，病理损伤接近人急性脑缺血的变化。通过行为学检查验证，造模后大鼠可以达到VD模型的标准。因此，笔者采用四血管阻断法(4－VO)建立VD动物模型。

血管性痴呆属中医学的“痴呆”、“呆病”、“神志病”等范畴。经云:“头者，精明之府也”，“脑为髓海”、“脑为元神之府”，“头者，诸阳之会，上丹于泥宫，百神所聚”。《医学心悟》有“肾主智，肾虚则智不足”之说。这些说明神明智能与脑、肾有关。本病病因病机是肾虚髓亏、痰瘀闭阻脑络，属本虚标实之证，而出现智能衰退及情志异常等表现。针灸治疗VD有一定的疗效［10］。本研究是在传统中医学理论及现代医学理论的指导下，结合导师多年的临床经验完成的，运用电针刺激四神聪和风池穴治疗VD。四神聪为百会穴前后左右各一寸处，属经外奇穴，同为各经脉之气会聚之处，功如其名，针之能调节阴阳，有宁心安神、明目聪耳、醒脑益智的功效。《太平圣惠方》云:“神聪四穴，理头风目眩，狂乱疯癫痫，针入三分。”风池具有平肝熄风、清头明目、醒脑安神作用，为治风之要穴。风池穴首载于《灵枢·热病》，属足少阳胆经穴位，胆主决断，在精神思维活动中具有判断事物做出决定的作用。已经研究表明，风池穴治疗中风疗效肯定。本组研究所选风池穴可以通过改善椎－基底动脉系统而改善脑部血液循环，改善脑的代谢，间接抑制痴呆的发展，维持残存的脑功能。四神聪穴可以活化大脑皮质细胞，改善脑功能，减轻因痴呆而产生的各种症状。两穴通电后患者有头清目明、精力充沛之感。其机制可能是脉冲电流通过上行网状激活系统使大脑细胞得到活化，皮质的兴奋性增高;同时，基底动脉供血增多，使脑血流量增多，从而思维活跃［11］。

随着分子生物学、分子免疫学的深入发展，炎症反应机制在脑缺血中的作用越来越受到重视。大量证据表明，脑缺血后的炎症反应与缺血后的继发性脑损伤密切相关。脑组织缺血后伴随着一系列的炎症反应，而VD主要与缺血性脑血管病有关。脑缺血后以IL－1β和TNF－α为代表的炎性细胞因子参与了机体免疫应答和炎症反应，且在发病后数天至1周内占主导作用。无论是炎性细胞因子过度表达，还是其诱发的其它活性物质的过度表达，都将使反应向不利于机体的方向发展。这些炎性细胞在健康成人体内含量很低，脑缺血后体内IL－1β和TNF－α的表达迅速增加，启动多种细胞因子级联反应，通过多种途径损伤神经元功能，可诱导细胞凋亡。实验证明，若用IL－1抗体、TNF－α抗体进行干预，脑缺血病灶可以缩小，促进神经功能恢复。

本研究发现造模后大鼠表现明显的学习记忆障碍，针刺治疗后可以缩短VD大鼠逃避潜伏期、增加VD大鼠穿越平台次数。TNF－α、IL－1β在VD大鼠 血清中的表达均较正常组增高，针刺治疗后显著降低，表明针刺对VD的脑保护作用是通过抑制VD大鼠脑内炎症这一途径实现的。

总之，针刺四神聪、风池后能缩短VD大鼠水迷宫逃避潜伏期、增加VD大鼠水迷宫穿越平台次数以及降低VD大鼠血清TNF－α、IL－1β的含量，抑制缺血所致的炎性细胞因子释放，减轻神经细胞的炎性损伤，从而改善VD大鼠学习记忆能力，并且电针更为显著，为临床针刺治疗VD提供一定的理论和实验依据。

［1］ 田金洲．中国痴呆诊疗指南［M］．北京:人民卫生出版社，20012:20－22

［2］ 郎森阳．血管性痴呆的诊断与鉴别［J］．中国临床康复，2004，16(8):3143－3145

［3］ 杜江，张德军，王勇，等．多奈哌齐对血管性痴呆小鼠海马caspase－3表达的影响［J］．中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21(5):443－445

［4］ 李思康，丁定明，刘茜，等．头针治疗血管性痴呆随机对照研究［J］．上海针灸杂志，2012，31(11):806 －807

［5］ 张亚敏，孙华，陈素辉．针灸干预血管性痴呆的临床研究进展［J］．针灸临床杂志，2012，28(8):65 －67

［6］ 窦金金，谢宁，吴颂，等．中医药治疗血管性痴呆的研究进展［J］．中医药信息，2011，28(4):140 －143

［7］ 李涓，张雪竹，韩景献．针灸治疗血管性痴呆临床研究进展［J］．针灸临床杂志，2012，28(3):72 －74

［8］ Schmidt－ Kastner R，Paschen W，Ophoff BG，et al．A modified fourvesselocclusion model for inducing in complete forebrain ischemia inrats［J］．Stroke，1989，20(7):936

［9］ 李忠仁．实验针灸学［M］．北京:中国中医药出版社，2007:219－253

［10］ 刘红梅，高天明，佟振清，等．急性脑缺血动物模型实验研究进展［J］．第一军医大学学报，1999，19(4):368 －370

［11］ 高维滨．针灸六绝［M］．2版．北京:中国医药科技出版社，2007:241－245