针康法对局灶性脑缺血大鼠运动功能及缺血区周围内皮素受体－β表达的影响*

唐 强，王宏宇，王 艳，邢艳丽，朱路文

(1．黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001;2．黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

缺血性卒中是临床常见病和多发病，随着诊疗技术的提高，其死亡率呈降低趋势，但后遗瘫痪率仍居高不下［1－2］。因此，如何减轻梗死后功能障碍已成为康复医学研究的重点［3］。缺血早期的微血管痉挛是造成脑损伤加重的重要因素［4］，ET－β受体正是具有强烈血管收缩效应物质－内皮素(ETs)的受体之一［5］，相关动物实验表明大鼠pMCAO后可导致ETs增加并作用于ET－β受体，使缺血区微血管痉挛，侧支血流无力进入高压力的痉挛血管内，缺血脑组织不能获得血氧供给，造成神经元的严重缺血而衰亡。本实验通过观察针康法对局灶性脑缺血大鼠缺血区周围ET－β受体表达的影响及对大鼠运动功能进行行为学评定，探讨针康法的作用机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物及分组

选取健康清洁级雄性Sprague－Dawley大鼠120只，体重(250±30)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。按照随机数字表法将120只大鼠随机分为5组:假手术组、模型组、针刺组、康复组以及针康组，再按脑缺血后的不同分为3天、7天、14天、21天共4个亚组，每组6只。

1．2 实验试剂和仪器

试剂:兔抗多克隆一抗为武汉博士德和北京博奥森PV6001(北京中山)，其它包括国产分析纯。仪器:美国moticam3000显微摄影成像系统，德国菜卡2135型切片机，上海一恒电热恒温箱，医用微波炉、华佗牌针灸针，OSPT－202六道电动跑台(北京立泰生物科技公司)。

1．3 造模方法

造模前进行1周电动跑台适应性训练(速度:10 m/min)，每天训练20 min。模型制备:大鼠造模前禁食不禁水24 h后称重，选用直径0．20～0．50 mm的强力钓鱼线，剪成长20 mm的栓线，并将一端修理成光滑球形，以10%水合氯醛(0．3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，将麻醉后大鼠四肢固定，颈部备皮、碘伏消毒后，行正中切口，钝性分离皮下结构，使颈总动脉暴露，同样暴露迷走神经颈内动脉和颈外动脉。参考Longa EZ方法［6］于颈总动脉近分叉处切口，插入与体质量相应直径的线栓，收紧备线，线栓沿颈内动脉推进，当进入约18 mm，可有轻微阻力感，证明线栓头端已达大脑中动脉处，扎紧备线，缝合，腹腔注射青霉素溶液防止伤口感染，术后动物注意保暖 。术后6 h参照 Longa EZ［6］的5分法进行评分。0分:无神经功能缺损症状;1分:轻度局灶性神经功能缺损，即提尾悬空不能伸展左侧前爪;2分:中度局灶性神经功能缺损，即行走向左侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损，即行走困难，并向左侧倾倒;4分:不能自发行走，意识水平下降。造模成功标准:评分为1～3分，剔除不合格大鼠，随时补充模型动物以保证每组只数固定。

1．4 干预方法

1．4．1 模型组 不予任何干预，造模后放回笼中，安静饲养按时间点进行行为学评定。

1．4．2 假手术组 不予任何干预，术后放回笼中，安静饲养按时间点进行行为学评定

1．4．3 针刺组 造模后24 h仅给予头穴丛刺干预，按照“大鼠穴位图谱”所示，取百会穴、百会左右侧旁开4 mm处向前或从顶前区颅中线及左右侧各旁开4 mm处向后进行针刺(应用头穴丛刺法)，以上针刺区域覆盖大鼠顶区、顶前区，进针后快速捻转1 min后留针3 h。

1．4．4 康复组 造模24 h后，将大鼠置于不断向后传输的履带上，大鼠不断地在电动履带上主动向前奔跑，以求避免履带尾部电栅栏的电击。运动跑台训练方案，每天训练20 min，速度:1～3天为5 m/min，4～14 天为 10 m/min，14 天后为15 m/min［7］。

1．4．5 针康组 造模后24 h同步同时进行头穴丛刺法结合跑台训练，方法同针刺组和康复组。

1．5 行为学评估方法

各组大鼠于造模后3天、7天、14天和21天4个时间点每组各6只大鼠，进行网屏试验，评估其运动功能。网屏试验:大鼠前爪抓住网屏可达5 s，且不滑落为0分;大鼠能够握住网屏，并且滑落一段距离，但未掉下为1分;大鼠在5 s内掉下为2分;网屏转动时大鼠即掉下为 3 分［8］。

1．6 标本采集及免疫组织化学染色

1．6．1 标本采集 各组大鼠在相应时间点进行运动功能评定后，将其麻醉且固定于手术台，使其心脏暴露，先后用0．9%生理盐水及4%多聚甲醛溶液各200 ml心脏灌注，将体内血液冲净(从右房流出的液体变清)，然后断头取脑，将脑组织存放入4%多聚甲醛溶液中固定，以备观察免疫组织化学。

1．6．2 免疫组织化学染色 分别经过脱水－透明－浸蜡－包埋－切片－脱蜡－脱水。滴加一抗(ET－β多克隆抗体)，PBS每次冲洗2 min共3次。滴加相应二抗，PBS冲洗2 min共3次。DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜下观察效果。

1．7 图片分析

在高倍镜(×400)下于梗死灶周围避开白质区神经核团随机选5个视野，统计出每个视野内呈现小胶质细胞形态的ET－β受体阳性细胞数，30个视野的平均数代表该标本的阳性细胞数。

1．8 统计学分析

应用SPSS17．0统计软件处理，组内比较采用重复测量方差分析，组间比较采用单因素方差分析方法，若方差齐，则采用LSD法进行分析，若方差不齐，则采用Dunnett法进行分析。

2 结果

2．1 运动功能

假手术组大鼠麻醉苏醒后活动正常，这说明了假手术本身并未对大鼠的神经功能以及运动功能造成影响。模型组各时期运动功能评分显著高于假手术组(P＜0．05)，具有统计学意义。针康组在3天和7天时评分与模型组无显著性差异(P＞0．05)，不具有统计学意义，14天和21天时评分低于模型组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点的运动功能评定比较

2．2 免疫组织化学指标试验结果

造模后大鼠脑梗死灶周围ET－β受体于3天时均有表达，见封三彩图1(阳性表达呈黄色或棕黄色)，并且分别在3天和7天时达到高峰，随后有不同程度的下降。与模型组相比，假手术组3天、7天和14天时有显著性差异(P＜0．05)，针康组和模型组相比，在3天、7天、和14天均有显著性差异(P＜0．05);与针刺组和康复组相比，针康组ET－β受体阳性细胞表达较少，造模后3天和7天均有显著性差异(P＜0．05)，见封三彩图2，相对于其它组别以较快的速度减低;21天时模型组、康复组、针刺组、针康组比较，差异无统计学意义(P＞0．05)。见表2。

表2 各组缺血区周围ET－β受体阳性细胞数比较(400×)(¯x±s)

3 讨论

针康法是由唐强教授［1］提出的康复理念，其方法是采用头穴丛刺结合康复训练治疗脑卒中。针康法具有双向调节功能，头穴丛刺的刺激信号能够透过颅骨直接刺激大脑皮质，以达到作用于中枢神经系统而改 善患侧运动功能之目的，头穴丛刺的同时进行运动训练使患侧重复运动信号向中枢神经系统传导，使遭到破坏的大脑运动支配区产生周围代偿、远隔代偿，局部功能重组［1］。针灸专家于致顺［9］最早提出头穴丛刺法这一概念，它是一种治疗脑梗死的有效方法，又分为七区划分法和长留针法。在长留针期间可以进行手法行针从而达到足够有效刺激量目的。头穴丛刺达到足够的刺激量可透过颅骨直接对大脑皮质神经产生刺激作用，从而改善神经细胞功能［10］，并且可以抑制神经细胞凋亡从而减缓由凋亡造成的脑损伤［11，12］。康复疗法可以改善脑卒中运动、感觉、平衡等功能障碍，出现可塑性变化，使受损的大脑功能得到改善［13］，相关实验表明，动物跑台训练能缩小脑梗死体积，促进神经功能的恢复［14］。

内皮素－B(endothelin－β，ET－β)受体是内皮素(endothelins，ETs)的一种特殊的 G 蛋白耦联受体［15］。ETs是一种具有强烈血管收缩效应的物质，是体内一种神经调节因子，起局部激素作用。有研究表明，脑缺血可导致ETs增加并作用于ET－β受体，诱导星形胶质细胞释放谷氨酸，加重神经元退行性变性［16］。Morga等［17］发现ET－β受体可增加一氧化氮释放，从而产生神经毒性作用。

为了更接近于临床康复中的实际情况，本实验各干预组在介入时间、单次训练时间及训练强度由小到大。实验结果显示，大鼠pMCAO造模后，针康组、针刺组、康复组、模型组大鼠半暗区内有大量ET－β受体阳性细胞，以缺血后3天、7天达高峰，之后总体峰值减低，21天时基本与假手术组相当。此变化规律与Morga等［17］发现一致。针康组大鼠脑梗死灶周围ET－β受体表达较模型组明显减少，与其它干预组相比，在3天、7天和14天时ET－β受体表达数目明显减少(P＜0．05)。在动物行为学评分发面，各组不同时间点的动物行为学评分，针康组均低于同期康复组、针刺组、模型组。本实验建立了针康法对神经功能的恢复和脑组织ET－β受体表达的关系:针康法能够降低大鼠脑梗死灶周围ET－β受体的表达，并加快其下降的趋势，从而有效地缓解血管痉挛，使缺血区脑组织细胞及时得到血流，及早地逆转恶性发病过程，并且减少其对神经元产生神经毒性作用，从而促进脑梗死后神经的再生，增加中枢神经系统的修复能力。

综上所述，本研究表明，相对于单纯的康复疗法，针康法能较好促进脑梗死大鼠运动功能的恢复，其机制可能与脑梗死灶周边区的ET－β受体阳性细胞数减少有关，其具体作用机制有待于进一步的研究。

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